Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области центриола, такие как локализация белка в определенной области центриола. Основным преимуществом этой техники является то, что мы предоставляем средства для концентрации центриола, чтобы получить их в нескольких ориентациях. Хотя этот метод может дать представление о хламидомонах центриола биологии, он также может быть применен к другой системе, такие как изолированные человека и парамеций центриолах.
Демонстрацией процедуры будет аспирант Николай Клена, еще одна аспирантка Maeva Le Guennec и постдок в лаборатории Давиде Гамбаротто. Чтобы начать эту процедуру, сначала подготовьте все средства массовой информации и культуры клеток C.Reinhardtii, как указано в текстовом протоколе. Перенесите подготовленные клетки на 50 миллилитровых конических трубок и центрифуга их в 600 раз г в течение 10 минут.
Вымойте гранулы один раз с 50 миллилитров 1x PBS и спина клетки снова в 600 раз г в течение 10 минут. Используйте пипетку для повторного перерасхода гранул в 100 миллилитров буфера дефлагелляции комнатной температуры. Поместите стакан на магнитный мешалку и медленно добавьте 0,5 молярной уксусной кислоты к окончательному рН от 4,5 до 4,7.
Пусть эта смесь инкубировать при комнатной температуре в течение двух минут. После этого медленно добавить капли одного нормального гидроксида калия, чтобы восстановить рН до 7,0, передать клетки 50 миллилитров труб, и центрифуга их в 600 раз г в течение 10 минут, чтобы удалить любой отдельный флагелла. Откажитесь от супернатанта и храните гранулы на льду до готовности к мытью.
Когда вы будете готовы, мыть гранулы в два раза с помощью 50 миллилитров 1x PBS при четырех градусах по Цельсию за стирку. Спин промывают гранулы на 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Повторное распределение гранул в 30 миллилитров 1x PBS.
Затем медленно загрузите подвеску на 20 миллилитровую подушку 25%-ную сахарозу, не смешивая. Спин при 600 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 15 минут, чтобы удалить оставшиеся flagella и распространения клеток сахарозы. Используя аспиратор, тщательно аспирировать супернатант, сохраняя только самые нижние 20 миллилитров.
Вымойте оставшуюся сахарозу, добавив 20 миллилитров холодного 1x PBS. Центрифуга при 600 раз g и 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Повторное распределение гранул в 10 миллилитров 1x PBS при четырех градусах по Цельсию, убедившись, что Есть нет сгустков в растворе.
Перенесите перерасходную гранулу в новую бутылку с 250 миллилитров, добавьте буфер лиза, дополненный 5 000 единицами DNase, в бутылку, содержащую клетки. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение одного часа, в то время как смешивание каждые 15 минут, тщательно инвертирования бутылки. Передача лисированных клеток в 50 миллилитров конической трубки и центрифуги в 600 раз g и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут.
Используя пипетку, соберите супернатант и загрузите его в 30 миллилитровую круглую нижнюю трубку на льду, содержащую два миллилитра 60%-ной подушки сахарозы. Центрифуга это при 10 000 раз г в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. После этого, аспирировать супернатант до одного миллилитра над подушкой сахарозы.
Обратите внимание на желтый интерфейс между одним миллилитром оставшегося супернатанта и двумя миллилитров подушки сахарозы. Используя наконечник P1000, аккуратно смешайте оставшийся супернатант с сахарозой. Бассейн все подушки сахарозы и хранить их на льду.
Затем приготовьте градиент сахарозы на 40%-70% в тонкостенной полипропилетовой трубке с 38,5 миллилитров, как указано в текстовом протоколе. Медленно загрузите объединяют интерфейсы в градиент. Сбалансировать трубки с буфером 10 миллимолярных K-PIPES и центрифугой в 68, 320 раз g и 4 градуса по Цельсию в течение 75 минут.
После этого используйте 0,8-миллиметровую иглу, чтобы сделать отверстие в нижней части трубки, убедившись, что не беспокоить различных слоев сахарозы. Используйте это отверстие, чтобы собрать 12 500 фракций микролитров при четырех градусах цельсия. Используя наконечник P200, подготовьте дополнительные 10 микролитров алицитов из каждой фракции, которые будут использоваться во время иммунофторесценции.
Затем, оснастки заморозить фракции в жидком азоте. Для начала поместите стерильный 12-миллиметровый крышку на утопленный нижний конец концентратора, убедившись, что держите сторону с покрытием PDL вниз. Поместите адаптер непосредственно на вершине, чтобы крышка крышки.
Затем переверните круглую нижнюю трубку и поместите ее на концентратор, крышку и адаптер. Используя пинцет, осторожно нажмите ансамбль, пока он не достигнет нижней части трубки, а затем инвертировать трубку. Добавьте 10 миллимоляра буфера K-PIPES, пока он не достигнет верхней части концентратора.
Убедитесь, что в центральном цилиндре концентратора нет пузырьков. Аккуратно добавьте 100 микролитров буфера 10 миллимолейных K-PIPES в одну из алицитов обогащенной центриолярной фракции и тщательно перемешайте с помощью пипетки P200. Затем удалите 100 микролитров буфера K-PIPES из полого центра концентратора и добавьте 100 микролитров смеси буферной фракции, убедившись, что содержимое остается в полом центре концентратора.
Спин при 10 000 раз г в течение 10 минут в центрифуге, которая предварительно охлаждается до четырех градусов по Цельсию. После этого используйте пинцет для удаления концентратора. Вставьте устройство ручной работы в отверстие, присутствуюющее в прорези края адаптера и поднимите осторожно, чтобы восстановить крышку.
Как только он достигает верхней части трубки, используйте перчаточный палец, чтобы поймать край адаптера и использовать пинцет, чтобы удалить крышку, памятуя о том, какая сторона крышки содержит центриолы. Затем выполняют фиксацию и иммунофлуоресценцию окрашивания концентрированных центриоля. Для начала инкубировать крышки с центриолами в подготовленной кристаллической полистирол передачи лабораторной коробке заполнены 100% метанола при минус 20 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
Используя пинцет, перенесите крышки в прозрачную лабораторную коробку, заполненную 50 миллилитров 1x PBS. Пусть слайды мыть в PBS в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем пипетки 60 микролитров первичного антитела смешиваются на кусок лабораторной герметизации обертывания в увлажненной камере.
Аккуратно положите крышки поверх смеси антител с центриолесами, непосредственно обращенных к капле. Пусть крышки инкубируют в течение 45 минут. После этого снимите крышки и вымойте их в коробке, содержащей PBS в течение пяти минут.
Инкубировать промывают крышки в течение 45 минут, со вторичными антителами в PBS 1%BSA и 0.05%Tween-20. Снимите крышки и мыть их в течение пяти минут в коробке, содержащей PBS. Используя обычную антиувядную среду монтажа, смонтировать крышку на слайде.
Затем, изображение изолированных центриолях на конфокальных микроскопах на 63X нефтяной цели с N.A.of 1.4, при применении деконволюции. Навейте верхнюю и нижнюю позицию q-stack выше и ниже сигнала центриола, соответственно, и приобретете большой стек изображений, включающий общий центриоальный сигнал. Проецируйте стек и выполняйте усреднение одночастиц, как указано в текстовом протоколе.
Представитель иммунофторесценции показывает, что шесть фракций обогащаются для изолированных центриолей, с пиком для фракции номер три, в то время как последние две фракции не являются, что свидетельствует о том, что очистка является успешной. Только около 30 centrioles увидены в поле зрения без концентратора, пока 183 увидены с концентратором. Это свидетельствует о том, что шаг концентратора является успешным и позволяет в шесть раз обогащать центриоля в определенном регионе, что облегчает их обнаружение и изображение.
Микроскопия супер-разрешения затем используется для изображения центриолов, окрашенных для monoglutamylated тубулина, и программное обеспечение используется для создания почти идеального среднего для каждой выбранной ориентации. После пяти итераций были созданы два класса средних моноглутамилированных центриолов: вид сверху с 63 объектов и вид сбоку от 98 частиц. Длина среднего класса бокового вида составляет 260 нанометров диаметром 250 нанометров, что сопоставимо с измеренным моноглутамилированным тубулином сигналом, который, как видно, локализуется в ядре центриола.
При выполнении этой процедуры, важно помнить, чтобы сохранить изолированный центриоле на льду и оснастки заморозить их после изоляции. После этой процедуры, другой метод, как криоэлектронная микроскопия и масс-спектрометрия может быть выполнена для того, чтобы ответить на дополнительный вопрос, такие как родная архитектура центриола или состав белка центриола.
