Este método puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo centriole, como la localización de proteínas en una región específica del centriole. La principal ventaja de estas técnicas que proporcionamos los medios para concentrar centriole para conseguirlas en múltiples orientaciones. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología centriole de Chlamydomonas, también se puede aplicar a otro sistema, como los centrioles humanos aislados y del paramecium.
Demostrando el procedimiento estarán Nikolai Klena, estudiante de doctorado Maeva Le Guennec, y el postdoc en el laboratorio Davide Gambarotto. Para comenzar este procedimiento, primero prepare todos los medios y la cultura de las células C.Reinhardtii como se describe en el protocolo de texto. Transfiera las células preparadas a tubos cónicos de 50 mililitros y centrifugarlas a 600 g durante 10 minutos.
Lavar el pellet una vez con 50 mililitros de 1x PBS y girar las células de nuevo a 600 g durante 10 minutos. Utilice una pipeta para resuspender el pellet en 100 mililitros de tampón de deflaglación a temperatura ambiente. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y agregue lentamente 0,5 molar ácido acético a un pH final de 4,5 a 4,7.
Dejar incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante dos minutos. Después de esto añadir lentamente gotas de un hidróxido de potasio normal para restaurar el pH a 7.0, transferir las células a tubos de 50 mililitros, y centrifugarlas a 600 veces g durante 10 minutos, para eliminar cualquier flagelo separado. Deseche el sobrenadante y guarde el pellet sobre hielo hasta que esté listo para lavar.
Cuando esté listo, lave el pellet dos veces con 50 mililitros de 1x PBS a cuatro grados centígrados por lavado. Gire el pellet lavado a 600 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 30 mililitros de 1x PBS.
A continuación, cargue lentamente la suspensión en un cojín de 20 mililitros de 25% de sacarosa, sin mezclar. Gire a 600 veces g y cuatro grados celsius durante 15 minutos para eliminar cualquier flagelo restante y extender las células en la sacarosa. Usando un aspirador, aspira cuidadosamente el sobrenadante manteniendo sólo los 20 mililitros más abajo.
Lave la sacarosa restante añadiendo 20 mililitros de PBS frío 1x. Centrifugar a 600 veces g y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Resuspender el pellet en 10 mililitros de 1x PBS a cuatro grados Celsius, asegurándose de que no haya grumos en la solución.
Transfiera el pellet resuspendido a una nueva botella de 250 mililitros, agregue el tampón de lysis, complementado con 5.000 unidades de DNase, al frasco que contiene las células. Incubar a cuatro grados centígrados durante una hora, mientras se mezcla cada 15 minutos invirtiendo cuidadosamente la botella. Transfiera las células de lesed a un tubo cónico de 50 mililitros y centrífuga a 600 veces g y cuatro grados Celsius durante 10 minutos.
Con una pipeta, recoja el sobrenadante y cárguelo en un tubo de fondo redondo de 30 mililitros sobre hielo que contenga dos mililitros de 60% de cojín de sacarosa. Centrifuga esto a 10.000 g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de esto, aspirar el sobrenadante hasta un mililitro por encima del cojín de sacarosa.
Observe la interfaz amarilla entre el mililitro de sobrenadante restante, y los dos mililitros de cojín de sacarosa. Con una punta P1000 cortada, mezcle suavemente el sobrenadante restante con la sacarosa. Agrupa todos los cojines de sacarosa y guárdalos en hielo.
A continuación, prepara un gradiente de 40% a 70% de sacarosa en un tubo de polipropileno de 38,5 mililitros de paredes delgadas como se describe en el protocolo de texto. Cargue lentamente las interfaces agrupadas en el degradado. Equilibre los tubos con el tampón K-PIPES de 10 mililitros y centrifugar a 68, 320 veces g y cuatro grados Celsius durante 75 minutos.
Después de esto, utilice una aguja de 0,8 milímetros para hacer un agujero en la parte inferior del tubo, asegurándose de no molestar a las diferentes capas de sacarosa. Utilice este agujero para recoger 12 fracciones de microlitro a cuatro grados centígrados. Con una punta P200 cortada, prepare una alícuota adicional de 10 microlitios de cada fracción que se utilizará durante la inmunofluorescencia.
A continuación, congele las fracciones en nitrógeno líquido. Para comenzar, coloque un cubreobjetos estéril de 12 milímetros en el extremo inferior empotrable del concentrador, asegurándose de mantener el lado recubierto de PDL hacia abajo. Coloque el adaptador directamente en la parte superior, para tapar el cubreobjetos.
A continuación, invierta el tubo de fondo redondo y colóquelo sobre el concentrador, el cubreobjetos y el adaptador. Usando pinzas, empuje suavemente el conjunto hasta que llegue a la parte inferior del tubo, y luego invierta el tubo. Agregue 10 milímetros de tampón K-PIPES hasta que llegue a la parte superior del concentrador.
Asegúrese de que no haya burbujas en el cilindro central del concentrador. Agregue suavemente 100 microlitros de 10 tampones K-PIPES mililares a una de las alícuotas de la fracción centriolar enriquecida y mezcle a fondo con una pipeta P200. A continuación, retire 100 microlitros de tampón K-PIPES del centro hueco del concentrador y agregue 100 microlitros de la mezcla de fracción de búfer, asegurándose de que el contenido permanezca en el centro hueco del concentrador.
Gire a 10.000 veces g durante 10 minutos en una centrífuga que se enfríe previamente a cuatro grados centígrados. Después de esto, utilice pinzas para quitar el concentrador. Inserte un dispositivo enganchado a mano en el orificio presente en el borde ranurado del adaptador y levante suavemente para recuperar el cubreobjetos.
Una vez que llegue a la parte superior del tubo, utilice un dedo enguantado para atrapar el borde del adaptador y utilice pinzas para quitar el cubreobjetos, teniendo en cuenta qué lado del cubreobjetos contiene centrioles. A continuación, realice la fijación y la tinción de inmunofluorescencia de los centrioles concentrados. Para empezar, incubar los cubreobjetos con los centrioles en la caja de laboratorio de transmisión de poliestireno de cristal preparada llena de 100% metanol a menos 20 grados centígrados durante 5 minutos.
Con pinzas, transfiera los cubreobjetos a una caja de laboratorio transparente llena de 50 mililitros de 1x PBS. Deje que los portaobjetos se laven en el PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, pipetear 60 microlitros de anticuerpo primario se mezclan en una pieza de envoltura de sellado de laboratorio en una cámara humidificada.
Coloque cuidadosamente los cubreobjetos en la parte superior de la mezcla de anticuerpos con los centrioles directamente frente a la gota. Deje que los cubreobjetos se incuban durante 45 minutos. Después de esto, retire los cubreobjetos y lávelos en una caja que contenga PBS durante cinco minutos.
Incubar los cubreobjetos lavados durante 45 minutos, con anticuerpos secundarios en PBS 1%BSA y 0.05%Tween-20. Retire los cubreobjetos y lávelos durante cinco minutos en una caja que contenga PBS. Con un medio de montaje antidescolorante normal, monte el cubreobjetos en una diapositiva.
A continuación, imagine los centrioles aislados en un microscopio confocal con un objetivo de aceite 63X con un N.A. de 1,4, mientras se aplica la desconvolución. Configure la posición superior e inferior de la pila Z por encima y por debajo de la señal centriole, respectivamente, y adquiera una gran pila de imágenes que comprenden la señal centriole total. Proyecte la pila y realice un promedio de una sola partícula como se describe en el protocolo de texto.
La inmunofluorescencia representativa revela que seis fracciones están enriquecidas para centrioles aislados, con un pico para la fracción número tres, mientras que las dos últimas fracciones no lo son, lo que indica que la purificación es exitosa. Sólo se ven alrededor de 30 céntimos por campo de visión sin el concentrador, mientras que 183 se ven con el concentrador. Esto demuestra que el paso del concentrador es exitoso y permite un enriquecimiento de seis veces de centrioles en una región definida, lo que facilita su detección e imagen.
La microscopía de super resolución se utiliza entonces para la imagen de centrioles manchados para la tubulina monoglutamilada, y el software se utiliza para generar un promedio casi perfecto para cada orientación elegida. Después de cinco iteraciones, se generaron dos clases de promedios de centrioles monoglutamilados: una vista superior de 63 objetos y una vista lateral de 98 partículas. La longitud del promedio de la clase de visión lateral es de 260 nanómetros con un diámetro de 250 nanómetros, comparable a la señal de tubulina monoglutamilada medida que se ve para localizar dentro del núcleo del centriole.
Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener el centriolo aislado sobre hielo y congelarlos rápidamente después del aislamiento. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía crioelectrófica y la espectrometría de masas para responder a preguntas adicionales, como la arquitectura nativa del centriole o la composición de la proteína centriole.
