Bu yöntem, centriole alanında anahtar soruya cevap yardımcı olabilir, centriole belirli bir bölgeye protein lokalize gibi. Bu tekniklerin en büyük avantajı, centriole'u birden fazla oryantasyona kazandırmak için konsantre olmamızdır. Bu yöntem Chlamydomonas centriole biyolojisi hakkında bilgi sağlasa da, izole edilmiş insan ve paramesyum centrioles gibi diğer sisteme de uygulanabilir.
Prosedürü gösteren doktora öğrencisi Nikolai Klena, bir diğer doktora öğrencisi Maeva Le Guennec ve davide Gambarotto laboratuvarında doktora sonrası olacak. Bu yordamı başlatmak için, öncelikle tüm medya ve kültür C.Reinhardtii hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi hazırlayın. Hazırlanan hücreleri 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 600 kez g'de santrifüj edin.
Peleti 50 mililitre 1x PBS ile yıkayın ve hücreleri 10 dakika boyunca 600 kez tekrar döndürün. Oda sıcaklığında deflagellation tampon 100 mililitre pelet resuspend için bir pipet kullanın. Bir manyetik karıştırıcı üzerine kabı yerleştirin ve yavaş yavaş 4,5 ila 4,7 son pH 0,5 molar asetik asit ekleyin.
Bu karışımı iki dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Bu yavaş yavaş 7.0 pH geri yüklemek için normal bir potasyum hidroksit damla eklemek sonra, hücreleri 50 mililitre tüplere aktarın ve 10 dakika boyunca 600 kez g santrifüj, herhangi bir müstakil kamçı kaldırmak için. Supernatant atın ve yıkamaya hazır olana kadar buz üzerinde pelet saklayın.
Hazır olduğunuzda, peleti yıkama başına dört santigrat derecede 50 mililitre 1x PBS kullanarak iki kez yıkayın. Yıkanmış peleti 600 kez g ve 4 santigrat derecede 10 dakika döndürün. 1x PBS 30 mililitre pelet resuspend.
Daha sonra süspansiyonu karıştırmadan %25 sakarozluk tan 20 mililitrelik bir yastığa yavaşça yükleyin. Kalan kamçıları çıkarmak ve hücreleri sakaroza yaymak için 15 dakika boyunca 600 kez g ve 4 santigrat derece de döndürün. Bir aspiratör kullanarak, dikkatle supernatant sadece alt-en 20 mililitre tutarak aspire.
Kalan sakaroz 20 mililitre soğuk 1x PBS ekleyerek yıkayın. Santrifüj 600 kez g ve 10 dakika boyunca 4 santigrat derece. Peleti 10 mililitre 1x PBS'de dört santigrat derecede yeniden askıya alın ve çözeltide küme lenme olmadığından emin olun.
Yeni bir 250 mililitrelik şişe için resuspended pelet aktarın, lysis tampon ekleyin, dNase 5, 000 birimleri ile takviye, hücreleri içeren şişeye. Şişeyi dikkatlice ters çevirerek her 15 dakikada bir karıştırArak bir saat boyunca dört derecede kuluçkaya yatırın. Lysed hücreleri 50 mililitrelik konik tüp ve santrifüj e 600 kez g ve 4 santigrat derece 10 dakika aktarın.
Bir pipet kullanarak, supernatant toplamak ve% 60 sakaroz yastık iki mililitre içeren buz üzerinde 30 mililitre yuvarlak alt tüp içine yükleyin. Bunu 10,000 kez g'de 4 santigrat derecede 30 dakika santrifüj edin. Bundan sonra, sakaroz yastığı üzerinde bir mililitre kadar supernatant aspire.
Kalan supernatant bir mililitre arasındaki sarı arayüzü unutmayın, ve sakaroz yastık iki mililitre. Kesilmiş bir P1000 ucu kullanarak, kalan supernatant'ı sakarozla hafifçe karıştırın. Tüm sakaroz yastıklarını havuza alın ve buzüzerinde saklayın.
Daha sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi ince duvarlı 38,5 mililitrelik polipropilen tüpte %40 ila %70 sakaroz gradyanı hazırlayın. Havuzlu arabirimleri yavaşça degradeye yükleyin. Tüpleri 10 milimolar K-PIPES tamponu yla dengeleyin ve 68, 320 kez g ve 4 santigrat derece ile 75 dakika boyunca santrifüj edin.
Bundan sonra, farklı sakaroz katmanları rahatsız değil emin olmak, tüp altında bir delik yapmak için 0.8 milimetrelik bir iğne kullanın. Dört santigrat derecede 12 500 mikrolitre kesirtoplamak için bu deliği kullanın. Bir kesme P200 ucu kullanarak, immünoresans sırasında kullanılmak üzere her fraksiyondan ek bir 10 mikrolitre aliquot hazırlamak.
Daha sonra sıvı nitrojendeki kesirleri tutturun. Başlamak için, pdl kaplı tarafı aşağıda tutmak için emin olun, konsantratörün gömme alt ucuna steril 12 milimetrelik bir kapak kayma yerleştirin. Adaptörü doğrudan üstüne yerleştirin, kapak kapağı için.
Daha sonra, yuvarlak alt tüp ters ve konsantratör, coverslip ve adaptör üzerine yerleştirin. Cımbız kullanarak, yavaşça tüpün altına ulaşana kadar topluluk itin ve sonra tüp ters. Konsantratörün tepesine ulaşana kadar 10 milimolar K-PIPES tamponekleyin.
Konsantratörün merkezi silindirinde kabarcık olmadığından emin olun. 10 milimolar K-PIPES tamponunun 100 mikrolitresini zenginleştirilmiş centriolar fraksiyonun aliquotlarından birine hafifçe ekleyin ve P200 pipet kullanarak iyice karıştırın. Daha sonra, 100 mikrolitre K-PIPES tamponu konsantratörün içi boş merkezinden çıkarın ve içindekilerin konsantratörün içi boş merkezinde kalmasını sağlayarak tampon fraksiyonkarışımının 100 mikrolitresini ekleyin.
Önceden soğutulmuş bir santrifüjde 10,000 kez g'de 10 dakika boyunca döndürün. Bundan sonra, konsantratörü çıkarmak için cımbız kullanın. Adaptörün oluklu kenarında bulunan deliğe el yapımı kancalı bir cihaz yerleştirin ve kapak kaymasını kurtarmak için hafifçe kaldırın.
Tüpün üst tarafına ulaştığında, adaptörün kenarını tuzağa düşürmek için eldivenli bir parmak kullanın ve kapağın hangi tarafında santrikül ler olduğuna dikkat edin. Daha sonra, konsantre centrioles fiksasyon ve immünofloresan boyama gerçekleştirin. Başlamak için, 5 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede %100 metanol le dolu hazırlanmış kristal polistiren iletim laboratuarı kutusundaki centrioles ile kapakları kuluçkaya yatırın.
Cımbız kullanarak, kapakları 50 mililitre 1x PBS ile dolu şeffaf bir laboratuvar kutusuna aktarın. Slaytlar oda sıcaklığında beş dakika PBS yıkama sağlar. Daha sonra, pipet 60 mikrolitre birincil antikor karışımı nın üzerine nemlendirilmiş bir odada ki laboratuvar sızdırmazlık sarması parçasının üzerine.
Kapaklarını antikor karışımının üzerine dikkatlice döşeyin ve doğrudan damlaya bakan centrioles'ları ayarlayın. Kapaklar 45 dakika kuluçkaya yatsın. Bundan sonra, kapakları çıkarın ve beş dakika pbs içeren bir kutu içinde yıkayın.
Yıkanmış kapakları 45 dakika kuluçkaya yatırın, PBS %1 BSA ve %0.05 Tween-20'de ikincil antikorlar. Kapakları çıkarın ve PBS içeren bir kutuda beş dakika yıkayın. Normal bir solmaya karşı montaj ortamı kullanarak, kapak kaymasını bir slaytüzerine titretin.
Daha sonra, bir konfokal mikroskop üzerinde bir 63X yağ hedefi bir N.A.of 1.4 ile izole centrioles görüntü, dekonvolution uygularken. Z-yığınının üst ve alt pozisyonunu sırasıyla centriole sinyalinin üstünde ve altında ayarlayın ve toplam centriole sinyalinden oluşan büyük bir görüntü yığını edinin. Yığını projelendirin ve metin protokolünde belirtildiği gibi tek parçacık ortalamasını gerçekleştirin.
Temsili immünoreskence altı fraksiyonları izole centrioles için zenginleştirilmiş olduğunu ortaya koymaktadır, kesir sayısı üç için bir tepe ile, son iki kesirler değildir, arınma başarılı olduğunu gösteren. Konsantratörü olmadan görüş alanı başına sadece 30 centrioles görülürken, 183'ü konsantratörile birlikte görülür. Bu, konsantratör adımının başarılı olduğunu gösterir ve tanımlanmış bir bölgede centrioles altı kat zenginleştirme sağlar, daha kolay tespit ve görüntü için yapım.
Süper çözünürlüklü mikroskopi daha sonra monoglutamylated tubulin için boyanmış centrioles görüntü için kullanılır ve yazılım seçilen her yönelim için neredeyse mükemmel bir ortalama oluşturmak için kullanılır. Beş yinelemeden sonra, monoglutamylated centrioles:63 nesnelerden bir üst görünüm ve 98 parçacıktan bir yan görünüm olmak üzere iki ortalama sınıfı oluşturuldu. Yan görüş sınıfı ortalamasının uzunluğu 250 nanometre çapında 260 nanometredir ve santimetrenin çekirdeğinde lokalize olduğu görülen ölçülen monoglutamylated tubulin sinyaliile karşılaştırılır.
Bu işlemi gerçekleştirirken, izole centriole buz üzerinde tutmak ve izolasyon sonra onları snap-freeze hatırlamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, centriole veya centriole protein bileşiminin doğal mimarisi gibi ek soruyu cevaplamak için kriyo-elektron mikroskobu ve kütle spektrometresi gibi başka bir yöntem de uygulanabilmektedir.
