Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Centriole-Feld zu beantworten, wie z. B. die Lokalisierung von Protein entosamung in eine bestimmte Region des Centriole. Der Hauptvorteil dieser Techniken, dass wir die Mittel zur Verfügung stellen, um Centriole zu konzentrieren, um sie in mehreren Ausrichtungen zu bekommen. Obwohl diese Methode Einblicke in Chlamydomonas centriole Biologie bieten kann, kann es auch auf andere System angewendet werden, wie isolierte menschliche und Paramecium-Zenriole.
Demonstriert wird das Verfahren von Doktorand Nikolai Klena, einer weiteren Doktorandin Maeva Le Guennec und dem Postdoc im Labor Davide Gambarotto. Um dieses Verfahren zu beginnen, bereiten Sie zunächst alle Medien und Kultur die C.Reinhardtii Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben vorzubereiten. Die vorbereiteten Zellen in 50 Milliliter konische Schläuche übertragen und 10 Minuten lang bei 600 mal g zentrifugieren.
Waschen Sie das Pellet einmal mit 50 Millilitern 1x PBS und drehen Sie die Zellen wieder bei 600 mal g für 10 Minuten. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet in 100 Milliliter Raumtemperaturdeflagellationspuffer wieder aufzuhängen. Legen Sie das Becherglas auf einen Magnetischen Rührer und fügen Sie langsam 0,5 Molessigsäure zu einem endgültigen pH-Wert von 4,5 bis 4,7 hinzu.
Lassen Sie diese Mischung bei Raumtemperatur für zwei Minuten inkubieren. Danach fügen Sie langsam Tropfen eines normalen Kaliumhydroxid, um den pH-Wert auf 7,0 wiederherzustellen, übertragen Sie die Zellen auf 50 Milliliter-Röhren, und zentrifugieren Sie sie bei 600 mal g für 10 Minuten, um alle abgelösten Flagella zu entfernen. Entsorgen Sie den Überstand und lagern Sie das Pellet auf Eis, bis es zum Waschen bereit ist.
Wenn Sie fertig sind, waschen Sie das Pellet zweimal mit 50 Millilitern 1x PBS bei vier Grad Celsius pro Wäsche. Drehen Sie das gewaschene Pellet bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Das Pellet in 30 Millilitern 1x PBS wieder aufhängen.
Dann die Aufhängung langsam auf ein 20-Milliliter-Kissen mit 25% Saccharose laden, ohne zu mischen. Drehen Sie bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 15 Minuten, um alle verbleibenden Flagella zu entfernen und die Zellen in der Saccharose zu verbreiten. Mit einem Aspirator, vorsichtig aspirieren sie den Überstand halten nur die untersten 20 Milliliter.
Waschen Sie die restliche Saccharose, indem Sie 20 Milliliter kalte 1x PBS hinzufügen. Zentrifuge bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten. Setzen Sie das Pellet in 10 Milliliter 1x PBS bei vier Grad Celsius wieder auf, um sicherzustellen, dass sich keine Klumpen in der Lösung befinden.
Übertragen Sie das resuspendierte Pellet in eine neue 250-Milliliter-Flasche, fügen Sie den Lysepuffer, ergänzt durch 5.000 Einheiten DNase, in die Flasche mit den Zellen. Bei vier Grad Celsius für eine Stunde inkubieren, während alle 15 Minuten durch sorgfältiges Umkehren der Flasche gemischt wird. Übertragen Sie die lysierten Zellen in ein 50 Milliliter konisches Rohr und Zentrifuge bei 600 mal g und vier Grad Celsius für 10 Minuten.
Mit einer Pipette den Überstand sammeln und in ein 30-Milliliter-Rundbodenrohr auf Eis mit zwei Millilitern 60%Saccharosekissen laden. Zentrifugieren Sie dies bei 10.000 mal g für 30 Minuten bei vier Grad Celsius. Danach den Überstand bis zu einem Milliliter über dem Saccharosekissen ansaugen.
Beachten Sie die gelbe Schnittstelle zwischen dem einen Milliliter des verbleibenden Überstandes und den zwei Millilitern Saccharosekissen. Mit einer geschnittenen P1000-Spitze den restlichen Überstand vorsichtig mit der Saccharose vermischen. Alle Saccharosekissen bündeln und auf Eis lagern.
Als nächstes bereiten Sie einen 40% bis 70% Saccharosegradienten in einem dünnwandigen 38,5 Milliliter Polypropylenrohr vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Laden Sie die gepoolten Schnittstellen langsam in den Farbverlauf. Balancieren Sie die Rohre mit dem 10 Millimolaren K-PIPES Puffer und Zentrifuge bei 68, 320 mal g und vier Grad Celsius für 75 Minuten.
Danach verwenden Sie eine 0,8-Millimeter-Nadel, um ein Loch in der Unterseite des Rohres zu machen, um sicherzustellen, dass die verschiedenen Saccharoseschichten nicht gestört werden. Verwenden Sie dieses Loch, um 12 500 Mikroliter-Fraktionen bei vier Grad Celsius zu sammeln. Mit einer geschnittenen P200-Spitze, bereiten Sie eine zusätzliche 10 Mikroliter Aliquot aus jeder Fraktion während der Immunfluoreszenz verwendet werden.
Dann fangen Sie die Fraktionen in flüssigem Stickstoff ein. Legen Sie zunächst einen sterilen 12-Millimeter-Deckel auf das eingelassene untere Ende des Konzentrators, um die PDL-beschichtete Seite nach unten zu halten. Legen Sie den Adapter direkt oben, um den Deckelzuschlag zu kappen.
Dann das rund-untere Rohr umkehren und über den Konzentrator, den Deckelund den Adapter legen. Mit einer Pinzette schieben Sie das Ensemble vorsichtig, bis es den Boden des Rohres erreicht, und dann das Rohr umkehren. Fügen Sie 10 Millimolar K-PIPES Puffer hinzu, bis er die Oberseite des Konzentrators erreicht.
Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen im Zentralzylinder des Konzentrators befinden. 100 Mikroliter 10 Millimolar K-PIPES Puffer vorsichtig zu einem der Aliquots der angereicherten Zentrriolarfraktion geben und mit einer P200 Pipette gründlich mischen. Als nächstes entfernen Sie 100 Mikroliter K-PIPES Puffer aus der Hohlmitte des Konzentrators, und fügen Sie 100 Mikroliter der Pufferfraktionsmischung hinzu, um sicherzustellen, dass der Inhalt im Hohlzentrum des Konzentrators verbleibt.
Drehen Sie bei 10.000 mal g für 10 Minuten in einer Zentrifuge, die auf vier Grad Celsius vorgekühlt ist. Danach verwenden Sie eine Pinzette, um den Konzentrator zu entfernen. Legen Sie ein handgefertigtes Gerät in das Loch ein, das in der Schlitzkante des Adapters vorhanden ist, und heben Sie es vorsichtig an, um den Deckelzuschlag wiederherzustellen.
Sobald es die Oberseite des Rohres erreicht, verwenden Sie einen Gehandicapfinger, um die Kante des Adapters zu fangen und verwenden Sie eine Pinzette, um den Deckelschlupf zu entfernen, wobei Sie darauf achten, welche Seite des Deckels Zenrios enthält. Führen Sie dann fixierende und immunfluoreszenzfärbung der konzentrierten Zenrios durch. Zunächst die Deckellipsen mit den Zenriolen in der vorbereiteten Kristall-Polystyrol-Getriebe-Laborbox, gefüllt mit 100%Methanol bei minus 20 Grad Celsius, für 5 Minuten inkubieren.
Mit einer Pinzette die Abdeckungen in eine transparente Laborbox mit 50 Millilitern 1x PBS zu übertragen. Lassen Sie die Dias in der PBS für fünf Minuten bei Raumtemperatur waschen. Dann mischen sich 60 Mikroliter Primärantikörper in einer befeuchteten Kammer auf ein Stück Labordichtungsfolie.
Legen Sie die Abdeckungen vorsichtig auf die Antikörpermischung mit den Centriolen direkt auf den Tropfen. Lassen Sie die Abdeckungen 45 Minuten lang inkubieren. Danach die Abdeckungen entfernen und fünf Minuten lang in einer PBS-Box waschen.
Inkubieren Sie die gewaschenen Abdeckungen für 45 Minuten, mit sekundären Antikörpern in PBS 1%BSA und 0.05%Tween-20. Entfernen Sie die Abdeckungen und waschen Sie sie für fünf Minuten in einer Box mit PBS. Montieren Sie den Deckelrutsch mit einem regelmäßigen Anti-Fading-Montagemedium auf einen Schlitten.
Dann stellen Sie die isolierten Zentrikel auf einem konfokalen Mikroskop bei einem 63X Ölobjektiv mit einem N.A.von 1,4, während sie Dekonvolution anwenden. Richten Sie die obere und untere Position des Z-Stacks oberhalb bzw. unterhalb des Centriole-Signals ein, und erfassen Sie einen großen Stapel von Bildern, die das gesamte Centriole-Signal umfassen. Projizieren Sie den Stapel, und führen Sie eine Einzelpartikelmittelung aus, wie im Textprotokoll beschrieben.
Repräsentative Immunfluoreszenz zeigt, dass sechs Fraktionen für isolierte Zenrios angereichert sind, mit einem Spitzenwert für Fraktion Nummer drei, während die letzten beiden Fraktionen dies nicht sind, was darauf hindeutet, dass die Reinigung erfolgreich ist. Nur etwa 30 Zentimeter werden pro Sichtfeld ohne den Konzentrator gesehen, während 183 mit dem Konzentrator zu sehen sind. Dies zeigt, dass der Konzentratorschritt erfolgreich ist, und ermöglicht eine sechsfache Anreicherung von Zenriolen in einer definierten Region, wodurch sie leichter erkannt und abgebildet werden können.
Super-Auflösungsmikroskopie wird dann verwendet, um Centrioles für monoglutamyiertes Tubulin zu beflecken, und Software wird verwendet, um einen nahezu perfekten Durchschnitt für jede gewählte Ausrichtung zu generieren. Nach fünf Iterationen wurden zwei Klassen von Durchschnittswerten von monoglutamyierten Centriolen generiert: eine Ansicht von 63 Objekten und eine Seitenansicht aus 98 Partikeln. Die Länge des Seitenansichtsklassendurchschnitts beträgt 260 Nanometer mit einem Durchmesser von 250 Nanometern, vergleichbar mit dem gemessenen monoglutamylierten Tubulinsignal, das im Kern des Zenriole lokalisiert wird.
Während dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, den isolierten Centriole auf Eis zu halten und sie nach der Isolierung einzufrieren. Nach diesem Verfahren kann eine andere Methode wie Kryo-Elektronenmikroskopie und Massenspektrometrie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie die native Architektur des Centriole oder die Centriole-Proteinzusammensetzung.
