Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo centrílo, como a localização de proteínas para uma região específica do centriole. A principal vantagem dessas técnicas que fornecemos os meios para concentrar centriole para obtê-los em múltiplas orientações. Embora este método possa fornecer insights sobre a biologia centriole das Clamídias, ele também pode ser aplicado a outro sistema, como centrítrios humanos isolados e paramecium.
Demonstrando o procedimento estarão o doutorando Nikolai Klena, outro doutorando Maeva Le Guennec e o pós-doutor no laboratório Davide Gambarotto. Para iniciar este procedimento, primeiro preparem todos os meios de comunicação e cultura das células C.Reinhardtii, conforme descrito no protocolo de texto. Transfira as células preparadas para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifuá-las a 600 vezes g por 10 minutos.
Lave a pelota uma vez com 50 mililitros de 1x PBS e gire as células novamente a 600 vezes g por 10 minutos. Use uma pipeta para resuspensar a pelota em 100 mililitros de tampão de deflagellação de temperatura ambiente. Coloque o béquer em um agitador magnético, e adicione lentamente 0,5 ácido acético molar a um pH final de 4,5 a 4,7.
Deixe essa mistura incubar em temperatura ambiente por dois minutos. Depois disso adicione lentamente gotas de um hidróxido de potássio normal para restaurar o pH para 7.0, transfira as células para tubos de 50 mililitros e centrifuá-las a 600 vezes g por 10 minutos, para remover qualquer flagela separada. Descarte o supernatante e guarde a pelota no gelo até estar pronto para lavar.
Quando estiver pronto, lave a pelota duas vezes usando 50 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius por lavagem. Gire a pelota lavada a 600 vezes g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Resuspend a pelota em 30 mililitros de 1x PBS.
Em seguida, carregue lentamente a suspensão em uma almofada de 20 mililitros de 25% de sacarose, sem misturar. Gire a 600 vezes g e quatro graus Celsius por 15 minutos para remover qualquer flagela restante e espalhar as células na sacarose. Usando um aspirador, aspire cuidadosamente o supernascida mantendo apenas o fundo mais de 20 mililitros.
Lave a sacarose restante adicionando 20 mililitros de 1x pbs frio. Centrifugar a 600 vezes g e 4 graus Celsius por 10 minutos. Resuspenja a pelota em 10 mililitros de 1x PBS a quatro graus Celsius, certificando-se de que não há aglomerados na solução.
Transfira a pelota resuspended para uma nova garrafa de 250 mililitros, adicione o tampão de lise, complementado com 5.000 unidades de DNase, para a garrafa contendo as células. Incubar a quatro graus Celsius por uma hora, enquanto mistura a cada 15 minutos invertendo cuidadosamente a garrafa. Transfira as células líricas para um tubo cônico de 50 mililitros e centrífuga a 600 vezes g e quatro graus Celsius por 10 minutos.
Usando uma pipeta, colete o supernasal e carregue-o em um tubo de fundo redondo de 30 mililitros no gelo contendo dois mililitros de 60% de almofada de sacarose. Centrifugar isso a 10.000 vezes g por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois disso, aspire o supernatante até um mililitro acima da almofada de sacarose.
Observe a interface amarela entre o mililitro de supernanato restante, e os dois mililitros de almofada de sacarose. Com uma ponta P1000 cortada, misture delicadamente o restante do supernatante com a sacarose. Acumule todas as almofadas de sacarose e guarde-as no gelo.
Em seguida, prepare um gradiente de 40% a 70% de sacarose em um tubo de polipropileno de paredes finas de 38,5 mililitros, conforme descrito no protocolo de texto. Carregue lentamente as interfaces agrupadas no gradiente. Equilibre os tubos com o tampão K-PIPES de 10 milômlares e a centrífuga a 68,320 vezes g e quatro graus Celsius por 75 minutos.
Depois disso, use uma agulha de 0,8 milímetros para fazer um furo na parte inferior do tubo, certificando-se de não perturbar as diferentes camadas de sacarose. Use este orifício para coletar 12 frações de microliter a quatro graus Celsius. Usando uma ponta P200 cortada, prepare uma alíquota adicional de 10 microliter de cada fração a ser usada durante a imunofluorescência.
Em seguida, congele as frações em nitrogênio líquido. Para começar, coloque uma tampa estéril de 12 milímetros na extremidade inferior rebaixada do concentrador, certificando-se de manter o lado revestido de PDL para baixo. Coloque o adaptador diretamente em cima, para tampar o deslizamento de tampa.
Em seguida, inverta o tubo de fundo redondo e coloque-o sobre o concentrador, o deslizamento e o adaptador. Usando pinças, empurre suavemente o conjunto até chegar ao fundo do tubo e, em seguida, inverta o tubo. Adicione 10 milimilitos de tampão K-PIPES até atingir a parte superior do concentrador.
Certifique-se de que não há bolhas no cilindro central do concentrador. Adicione suavemente 100 microliters de 10 mililitros de tampão K-PIPES a uma das alíquotas da fração centrilar enriquecida e misture completamente usando uma pipeta P200. Em seguida, remova 100 microliters de tampão K-PIPES do centro oco do concentrador e adicione 100 microliters da mistura de fração tampão, certificando-se de que o conteúdo permaneça no centro oco do concentrador.
Gire a 10.000 vezes g por 10 minutos em uma centrífuga que é pré-resfriada a quatro graus Celsius. Depois disso, use pinças para remover o concentrador. Insira um dispositivo fisgado à mão no orifício presente na borda ranhulada do adaptador e levante suavemente para recuperar a mancha de cobertura.
Uma vez que ele atinge a parte superior do tubo, use um dedo enluvado para prender a borda do adaptador e use pinças para remover o deslizamento de tampa, tendo em mente qual lado do deslizamento contém centríclicos. Em seguida, realize a fixação e a coloração da imunofluorescência dos centríse concentrados. Para começar, incubar as tampas com os centrículos na caixa de laboratório de transmissão de poliestireno de cristal preparado preenchida com 100% de metanol a menos 20 graus Celsius por 5 minutos.
Usando pinças, transfira as tampas para uma caixa de laboratório transparente cheia de 50 mililitros de 1x PBS. Deixe os slides lavarem no PBS por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, pipeta 60 microliters de anticorpos primários se misturam em um pedaço de envoltório de selagem de laboratório em uma câmara umidificada.
Coloque cuidadosamente as tampas em cima da mistura de anticorpos com os centrículos voltados diretamente para a queda. Deixe as tampas incubarem por 45 minutos. Depois disso, remova as tampas e lave-as em uma caixa contendo PBS por cinco minutos.
Incubar as tampas lavadas por 45 minutos, com anticorpos secundários em PBS 1%BSA e 0,05% Tween-20. Remova as tampas e lave-as por cinco minutos em uma caixa contendo PBS. Usando um meio de montagem anti-desbotamento regular, monte a mancha de cobertura em um slide.
Em seguida, imagem os centrículos isolados em um microscópio confocal em um objetivo de óleo 63X com um N.A.de 1.4, enquanto aplica a desconvolução. Configure a posição superior e inferior da pilha Z acima e abaixo do sinal centriole, respectivamente, e adquira uma grande pilha de imagens que compõem o sinal centriole total. Projete a pilha e execute a média de partículas únicas conforme descrito no protocolo de texto.
A imunofluorescência representativa revela que seis frações são enriquecidas para centrículos isolados, com pico para a fração número três, enquanto as duas últimas frações não são, indicando que a purificação é bem sucedida. Apenas cerca de 30 centrículos são vistos por campo de visão sem o concentrador, enquanto 183 são vistos com o concentrador. Isso demonstra que o passo do concentrador é bem sucedido, e permite um enriquecimento de centrículos seis vezes em uma região definida, facilitando a detecção e imagem deles.
A microscopia de super resolução é então usada para imagem centríles manchadas de tubulina monoglutamata, e o software é usado para gerar uma média quase perfeita para cada orientação escolhida. Após cinco iterações, duas classes de médias foram geradas de centrírioles monoglutamatados: uma visão superior de 63 objetos e uma visão lateral de 98 partículas. O comprimento da média da classe de visão lateral é de 260 nanômetros com um diâmetro de 250 nanômetros, comparável ao sinal de tubulina monoglutamilado medido que é visto para localizador dentro do núcleo do centriole.
Ao realizar este procedimento, é importante lembrar de manter o centriole isolado no gelo e congelá-los após o isolamento. Após esse procedimento, outro método, como microscopia crio-elétron e espectrometria de massa, pode ser realizado para responder a perguntas adicionais, como a arquitetura nativa do centriole ou a composição da proteína centriola.
