一种用于生物技术相关金黄色葡萄球菌感染活体可视化和内膜分析的斑马鱼胚胎模型

这种方法可以帮助回答以下关键问题:生物材料如何影响感染的易感性，它们如何影响这种感染的进展，以及它们如何影响体内此类生物材料周围的免疫细胞行为。该技术的主要优点是，它提供了一种新的动物模型，允许体内可视化和生物材料相关感染的活体内分析。这种方法的视觉演示至关重要，因为生物材料微球的注入是一个非常微妙的过程。

为了产生仅细菌的悬浮液，首先将荧光葡萄球菌菌株的四到五个菌落转移开，在试菌大豆农业板上培养，每毫升氯霉素补充10微克，制成10毫升的尝试性大豆汤，辅以氯霉素，在37摄氏度的中对数生长阶段生长，并摇动。当培养达到 620 纳米 0.4 至 0.8 的光学密度测量时，通过离心收集细菌，每次洗涤用一毫升无菌 PBS 洗涤细胞两次。第二次洗涤后，将颗粒重新悬浮在1.1毫升PVP中，并在再次测量光学密度之前，对细菌悬浮液进行涡流。

然后根据实验要求用PVP调整细菌悬浮液的浓度，产生细菌性悬浮液。为了产生细菌微球悬浮液，将商业聚苯乙烯微球PS-10离心机，并在仅细菌悬浮液中重新悬浮微球颗粒。使用 1/2 体积的 PVP 稀释细菌微球悬浮液，以达到悬浮液中细菌的适当浓度，约为仅细菌悬浮液的 2/3。

通过涡流混合悬浮液。要检查细菌和细菌微球悬浮液的浓度，在96孔板的单个孔中加入100微升每个悬浮液。在随后的孔中，在 90 微升无菌 PBS 中连续稀释悬浮液的 10 微升等等，每个稀释步骤都采用新提示。

将未稀释和稀释的细菌悬浮液的重复 10 微升等同液涂抹在加糖板上，并在 37 摄氏度下孵育板过夜。第二天早上，数一数菌落，计算准备好的细菌仅和细菌微球悬浮液中的细菌数量。收集斑马鱼胚胎后，丢弃任何不透明的不可行的胚胎，并在28摄氏度的新鲜E3培养基下孵育约60个每100毫升培养皿。

麻醉后，将GP阳性胚胎封存，进行荧光显微镜检查。将它们转移到一个100毫升的E3培养皿。要创建注塑模具，请用 1 至 1.5% 的液体气糖填充 100 毫升 Petri 盘。

使用塑料模具模板在红糖中创建凹槽。当加糖凝固时，去除模具，用E3介质覆盖加糖，并辅以0.02%三分素。受精后的第三天，用钳子打破拉玻璃微胶囊针的尖端，在光学显微镜下用大约20微米的外径实现尖端，在眼部有刻度杆。

针尖开口的调整对于微球的注入是实用的。开口的直径需要为不同大小的微球进行调整。然后使用微加载器移液器尖端将针头装载约 20 微升的细菌微球或仅细菌悬浮液，然后将针头安装到连接到微注射器的微操纵器上。

现在将选定的胚胎转移到凹槽的红糖板中。等待五分钟后，胚胎被麻醉，将胚胎在凹槽内以单一方向对齐，进行注射。将显微注射器设置为适当的注射设置，并在立体显微镜下以 45 至 60 度角将针头插入第一个胚胎的肌肉组织。

根据需要轻轻来回移动针头，以调整组织内的位置，并使用微注射器脚踏板注入加载的悬架。当将细菌微球悬浮液注射到斑马鱼胚胎的组织时，应用稳定的手轻轻插入针头。成功插入后，应在喷射前为材料创建空间。

当所有胚胎都注射后，在立体荧光显微镜下对胚胎进行评分，以成功注射，并在48孔板的单个孔中保持胚胎在E3介质中，且具有每日介质变化。为了通过菌落形成单位定量监测感染进展，在注射后不久将5至6个存活的受感染胚胎随机移植到单个两毫升微管中，然后用无菌PBS轻轻清洗胚胎。丢弃洗涤液后，在每个管中加入100微升无菌PBS，然后加入2至3个直径两毫米的无菌氧化珠。

然后以3，500转/小时将胚胎粉碎在均质器中，持续30秒，并培养均质，如所证明的。将含有E3介质的100毫米培养皿放在立体荧光显微镜舞台上，在培养皿中加入500微升2%甲基纤维素。要通过荧光显微镜监测感染进展，请配备适当的亮场和荧光过滤器，将麻醉受感染的胚胎水平对齐到培养皿中的甲基纤维素点。

使用亮场过滤器，以 160 倍的放大倍率将受损的注射组织对焦。将 Z 堆栈深度设置为 10 微米，将步长设置为 5 微米，以便连续录制三张图像。然后在相同的优化设置下以 160 倍的放大倍率成像单个胚胎。

使用 ImageJ 中的 ObjectJ 插件分析图像。金黄色葡萄球菌的肌肉注射在胚胎中引发剂量依赖性感染，在胚胎中观察到可行的感染进展，在注射后的第一天和第二天施以高挑战剂量。如所证明，在微球存在或不存在的情况下，可以注射类似数量的细菌。

通常，所有具有20多个金黄色葡萄球菌成分之一的胚胎在显微评分下对荧光呈阳性，尽管微球的存在似乎没有显著影响低剂量受挑战胚胎的感染进展。在高量接受的受挑战胚胎中，显微评分并不显示有或没有微球的受感染胚胎频率有任何差异，但定量培养表明，与注射后两天从金黄色葡萄球菌群胚胎中检索到的胚胎相比，从胚胎中检索到的菌落形成单位数较高。生物材料的存在影响免疫细胞反应和感染的初始易感性。

例如，在注射后五小时，对金黄色葡萄球菌注射反应的巨噬细胞的渗透明显高于对金黄色葡萄球菌加微球注射的反应，而在注射后一天，具有微球的胚胎比没有微球的金黄色葡萄球的胚胎明显高于金黄色葡萄球菌感染水平。重要的是要记住，始终调整针尖的开口到生物材料的大小，并调整细菌浓度的比例在细菌只悬浮和细菌微球悬浮。这种斑马鱼胚胎模型允许体内可视化和体内对感染进展和在生物材料存在和不存在的情况下被刺激的免疫细胞反应进行体内分析。

该技术为抗菌生物材料的发展和安全医疗器械的治疗策略提供了一种新的全动物模型。