この方法は、生体物質が感染に対する感受性にどのような影響を与えるか、それらがそのような感染症の進行にどのような影響を与えるか、そしてそれらが生体内でのそのような生体物質の周りの免疫細胞の挙動にどのような影響を与えるかについての重要な質問に答える助けになる。この技術の主な利点は、生体内の視覚化と生体物質関連感染症の生体内分析を可能にする新しい動物モデルを提供することです。生体物質微小球の注入は非常に繊細な手順であるため、この方法の視覚的実証は重要です。
細菌のみの懸濁液を生成するには、最初に蛍光ステープルアウレウスmCherry株の4〜5コロニーを移し、クロラムフェニコール1ミリリットル当たり10マイクログラムを補充したトリプティック大豆農業プレートで培養し、クロラムフェニコールを補ったトリプティック大豆スープ10ミリリットルに培養し、37度で中二類期成長期の成長のために。培養液が620ナノメートルの0.4~0.8で光学濃度測定に達したら、遠心分離で菌を採取し、1回の洗浄につき1ミリリットルの滅菌PBSで細胞を2回洗浄する。2回目の洗浄後、ペレットを1.1ミリリットルのPVPで再懸濁し、再び光学濃度を測定する前に細菌懸濁液をボルテックスする。
次に、実験要件に従ってPVPで細菌懸濁液の濃度を調整し、細菌のみの懸濁液を生成する。細菌微小球懸濁液を生成するために、遠心分離物市販のポリスチレン微小球、PS−10、及び細菌のみの懸濁液中の微小球ペレットを再懸濁させる。細菌のみの懸濁液の約2/3である懸濁液中の細菌の適切な濃度に達するためにPVPの1/2容量で細菌微小球懸濁液を希釈します。
ボルテックスで懸濁液を混ぜます。細菌のみのと細菌の微小球懸濁液の濃度を確認するには、各懸濁液の100マイクロリットルを96ウェルプレートの個々のウェルに加えます。その後のウェルで90マイクロリットルの無菌PBS中の懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを連続して希釈し、各希釈工程に新鮮な先端を使用する。
希釈されていない細菌懸濁液の10マイクロリットルのアリコートを寒天プレートに適用し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、コロニーを数えて、調製された細菌のみの細菌および細菌の微小球懸濁液内の細菌の数を計算する。ゼブラフィッシュ胚を採取した後、透明でない非生存可能な胚を捨て、新鮮なE3培地で摂氏28度で100ミリリットルのペトリ皿あたり約60個の胚をインキュベートする。
麻酔後、蛍光顕微鏡用GFP陽性胚を隔離する。E3培地の100ミリリットルのペトリ皿に移します。射出型を作成するには、100ミリリットルのペトリ皿に1〜1.5%の液体アガロースを充填します。
プラスチックモールドテンプレートを使用して、アガロースに溝を作成します。アガロースが固まったら、金型を取り除き、0.02%トリカインを添加したE3培地で寒天を覆います。1日3回の受精後、引っ張られたガラスのマイクロキャピラリー針の先端を壊すために鉗子を使用して、眼のスケールバーを持つ光顕微鏡下で約20マイクロメートルの外径の先端を達成する。
針先の開口部の調整は、微小球の注入に実用的である。開口部の直径は、異なるサイズの微小球に合わせて調整する必要があります。次に、マイクロローダーのピペットチップを使用して、細菌のマイクロスフィアまたは細菌のみの懸濁液の約20マイクロリットルで針をロードし、マイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレータに針を取り付けます。
今、溝状のアガロースプレートに選択した胚を転送します。胚が麻酔されるまで5分待った後、その注射のための単一の向きに溝の中の胚を整列させる。マイクロインジェクターを適切な注射設定に設定し、ステレオ顕微鏡下で第1の胚の筋肉組織に45〜60度の角度で針を挿入する。
必要に応じて針を前後にそっと動かして組織内の位置を調整し、マイクロインジェクターフットペダルを使用してロードされたサスペンションを注入します。ゼブラフィッシュ胚の組織に細菌微小球懸濁液を注入する場合、針は穏やかに挿入されるべきであるが、安定した手で。挿入が成功した後、射出前に材料用のスペースを作成する必要があります。
すべての胚が注入されたら、ステレオ蛍光顕微鏡下で正常に注射するために胚をスコアし、毎日の培地変化を伴う48ウェルプレートの個々のウェルにトリケインなしでE3培地の胚を維持する。コロニー形成ユニット定量による感染進行を監視するために、注射直後に5〜6個の生存可能な感染胚を個々の2ミリリットルマイクロチューブに無作為に移し、胚を滅菌PBSで穏やかに洗浄する。各チューブに100マイクロリットルの無菌PBSを加え、続いて2~3個の無菌2ミリメートル径ジルコニアビーズを加えます。
次に、3、500rpmでホモジナイザーで胚を30秒間粉砕し、実演したようにホモゲネートを培養する。ステレオ蛍光顕微鏡ステージに0.02%トリケーヌを添加したE3培地を含む100ミリメートルのペトリ皿を置き、ペトリ皿に2%メチルセルロースの500マイクロリットルを加えます。蛍光顕微鏡による感染の進行を監視するには、適切な明視野フィルターと蛍光フィルターを装備し、ペトリ皿のメチルセルロースのスポットに麻酔を付けた感染した胚を水平に整列させます。
明視野フィルターを使用して、損傷した注入された組織を160倍の倍率で焦点にします。Zスタック深度を10マイクロメートルに、ステップサイズを5マイクロメートルに設定して、3つの連続した画像を記録できるようにします。その後、160倍の拡大で同一の最適化された設定で個々の胚を画像化します。
ImageJ の ObjectJ プラグインを使用して、イメージを分析します。ステープルアウレウスの筋肉内注射は、胚における用量依存性感染を開始し、胚で観察される生存可能な感染進行は、注射後1日目と2日目に高挑戦用量を投与した。実証されるように、微小球の存在下または存在しない場合に同様の数の細菌を注入することができる。
典型的には、20以上のコロニー形成ユニットを有する全ての胚は、微視的スコアリング下で蛍光に陽性であるが、微小球の存在は低用量の挑戦的な胚における感染進行に有意に影響を及ぼさないようだ。高寄剤の挑戦的胚では、微小採点は微小球の有無にかかわらず感染した胚頻度の違いを示さないが、定量的培養は、注射後2日にステープルアウレウスのみの群から採取されたものと比較して、ステープルアウレウスプラス微小球群の胚から取り出されたより高いコロニー形成ユニット数を明らかにする。生体材料の存在は、免疫細胞応答と感染に対する初期の感受性の両方に影響を与える。
例えば、注射後5時間で、ステープルアウレウスのみの注射に応答するマクロファージ浸潤は、ステープルアウレウスと微小球注射に応答するよりも有意に高く、注射後のある日では、微小球を有する胚は微小球のない胚よりも有意に高いレベルのステープルアウレウス感染を示す。常に生体材料の大きさに針先の開口部を調整し、細菌のみの懸濁液と細菌の微小球懸濁液中の細菌濃度の比率を調整することを忘れないでください。このゼブラフィッシュ胚モデルは、生体物質の存在下および存在しない中での感染進行および誘発された免疫細胞応答のインビボ視覚化およびインビタル分析を可能にする。
この技術は、抗菌バイオマテリアルの開発と安全な医療機器の治療戦略のための新しい全動物モデルを提供します。
