Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как биоматериалы влияют на восприимчивость к инфекции, как они влияют на прогрессирование таких инфекций, и как они влияют на поведение иммунных клеток вокруг таких биоматериалов in vivo. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает новую модель животных, которая позволяет визуализации in vivo и интравитального анализа биоматериала связанных инфекций. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку инъекция биоматериальных микросфер является очень деликатной процедурой.
Для генерации бактерий только подвеска, сначала передать четыре-пять колоний флуоресцентного золотистого стафилококка mCherry штамма, культурный на триптических сое сельскохозяйственных пластин, дополненных 10 микрограммов на миллилитр хлорамфеникол в 10 миллилитров триптического соевого бульона, дополненного хлорамфеникол, для роста в середине фазы роста в 37 градусов по Цельсию. Когда культура достигает оптического измерения плотности на 620 нанометров от 0,4 до 0,8, собирать бактерии центрифугации, и мыть клетки в два раза с одним миллилитр стерильных PBS за стирку. После второй стирки, повторно гранулы в 1,1 миллилитров PVP, и вихрь бактериальной суспензии перед измерением оптической плотности снова.
Затем отрегулируйте концентрацию бактериальной суспензии с PVP в соответствии с экспериментальными требованиями для генерации бактерий только подвески. Для генерации бактерий микросферы подвески, центрифуга коммерческих микросфер полистирола, PS-10, и повторно микросферы гранулы в бактериях только подвески. Разбавить бактерии микросферы подвески с 1 / 2 объема PVP для достижения соответствующей концентрации бактерий в подвеске, что составляет примерно 2/3, что в бактериях только подвески.
Смешайте подвеску вихрем. Чтобы проверить концентрацию бактерий только и бактерий микросферы подвески, добавить 100 микролитров каждой подвески в отдельных скважин 96-хорошо пластины. Серийно разбавляют 10 микролитровых алицитов суспензий в 90 микролитров стерильных PBS в последующих скважинах, используя свежие наконечники для каждого шага разбавления.
Нанесите дубликаты 10-микролитровых алицитов неразбавленных и разбавленных бактериальных суспензий на агаровые пластины и инкубируйте пластины на ночь при 37 градусах Цельсия. На следующее утро подсчитайте колонии, чтобы вычислить количество бактерий в подготовленных бактерий только и бактерий микросферы суспензий. После сбора эмбрионов зебры, отбросить любые непрозрачные неприкосновенные эмбрионы, и инкубировать около 60 эмбрионов на 100-миллилитровую чашку Петри при 28 градусах по Цельсию в свежем E3 среде.
После анестезии, секвестр GFP-положительных эмбрионов для флуоресценции микроскопии. Перенесите их в 100-миллилитровую чашку Петри E3 среды. Чтобы создать форму для инъекций, заполните 100-миллилитровую чашку Петри с 1 до 1,5% жидкой агарозы.
Используйте пластиковый шаблон формы для создания канавки в агарозе. Когда агароза затвердеет, удалить плесень, и покрыть агар с E3 среды дополняется 0,02% tricaine. Один день три после оплодотворения, использовать типсы, чтобы сломать кончик вытащил стекла микрокапильярии иглы для достижения советы с примерно 20 микрометров внешнего диаметра под световым микроскопом с шкалой бар в глазу.
Корректировка отверстия кончика иглы практична для инъекций микросфер. Диаметр отверстия необходимо регулировать для микросфер разного размера. Затем используйте наконечник пипетки Microloader для загрузки иглы с приблизительно 20 микролитров бактерий микросферы или бактерий только подвески, и смонтировать иглу на микроманипулятор подключен к микроинжектору.
Теперь перенесите отобранные эмбрионы на рифленую агарозную пластину. После ожидания пять минут для эмбрионов, чтобы быть анестезированной, выровнять эмбрионы в канавки в одной ориентации для их инъекции. Установите микроинъектор в соответствующие настройки инъекции, и вставьте иглу в мышечную ткань первого эмбриона под углом от 45 до 60 градусов под стерео микроскопом.
Аккуратно переместите иглу вперед и назад, чтобы регулировать положение в ткани по мере необходимости, и используйте педаль ноги микроинжектора для введения загруженной подвески. При введении бактерии микросферы подвески в ткани эмбрионов зебры, игла должна быть вставлена мягко, но с устойчивой рукой. После успешной вставки, пространство должно быть создано для материалов перед инъекцией.
Когда все эмбрионы были введены, оценка эмбрионов для успешной инъекции под стерео флуоресценции микроскопа, и поддерживать эмбрионы в E3 среды без трикаина в отдельных скважин 48-хорошо пластин с ежедневными средними изменениями. Чтобы контролировать прогрессирование инфекции путем количественной оценки единицы колонии, случайным образом переносите пять-шесть жизнеспособных инфицированных эмбрионов в отдельные двухми миллилитровые микротрубки вскоре после инъекции и аккуратно моете эмбрионы стерильным PBS. После отбрасывания моет, добавить 100 микролитров стерильных PBS к каждой трубке, а затем два-три стерильных двухмиллиметрового диаметра zirconia бисером.
Затем раздавить эмбрионы в гомогенизатор на 3500 об / мин в течение 30 секунд, и культуры гомогената, как попродемонстрировано. Поместите 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую E3 medium, дополненную 0,02%tricaine на стадии стерео флуоресценции микроскопа, и добавьте 500 микролитров 2%метилцеллюлозы в чашку Петри. Для мониторинга прогресса инфекции с помощью микроскопии флуоресценции, оборудовать соответствующие ярко-полевые и флуоресцентные фильтры, выровнять анестезированы инфицированных эмбрионов горизонтально в месте метилцеллюлозы в чашке Петри.
Используйте фильтр яркого поля, чтобы привести поврежденные инъекционные ткани в фокусе при 160-х увеличении. Установите глубину стека в 10 микрометров и размер шага на пять микрометров, чтобы обеспечить запись трех последовательных изображений. Затем изображение отдельных эмбрионов при идентичных оптимизированных настройках при увеличении в 160 раз.
Для анализа изображений используйте плагин ObjectJ в ImageJ. Внутримышечная инъекция золотистого стафилококка инициирует дозозависимых инфекций в эмбрионах, с жизнеспособной прогрессирование инфекции наблюдается в эмбрионах вводят высокие дозы вызов в дни один и два после инъекции. Как было продемонстрировано, можно вводить такое же количество бактерий в присутствии или отсутствии микросфер.
Как правило, все эмбрионы с более чем 20 колоний формирования единиц стафилококка золотистого мчерри являются положительными для флуоресценции под микроскопическим скоринга, хотя наличие микросфер, кажется, не существенно влияет на прогрессирование инфекции в низкой дозе оспаривается эмбрионов. В высокодоусенные оспаривается эмбрионов, микроскопические скоринга не демонстрирует каких-либо различий в частоте инфицированных эмбрионов с или без микросфер, но количественная культура показывает более высокие колонии формирования единицы номера, извлеченные из эмбрионов в золотистый стафилококк плюс микросферы группы по сравнению с теми, собранные из стафилококка аурея только группы в два дня после инъекции. Наличие биоматериала влияет как на иммунный клеточный ответ, так и на первоначальную восприимчивость к инфекции.
Например, в течение пяти часов после инъекций инфильтрация макрофагов в ответ на инъекцию только золотистого стафилококка значительно выше, чем в ответ на инъекцию золотистого стафилококка плюс микросферы, в то время как в один прекрасный день после инъекции эмбрионы с микросферами демонстрируют значительно более высокий уровень стафилококковой инфекции, чем эмбрионы без микросфер. Важно помнить, чтобы всегда корректировать открытие кончика иглы до размера биоматериалов и корректировать соотношение концентрации бактерий в бактериях только подвески и бактерий микросферы подвески. Эта модель эмбриона зебры позволяет визуализации in vivo и интравитального анализа прогрессирования инфекции и спровоцированных иммунных клеточных реакций в присутствии и отсутствии биоматериалов.
Этот метод предоставляет новую модель всего животного для разработки противомикробных биоматериалов и стратегий лечения безопасных медицинских устройств.
