Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie Biomaterialien die Anfälligkeit für Infektionen beeinflussen, wie sie das Fortschreiten solcher Infektionen beeinflussen und wie sie das Verhalten von Immunzellen um solche Biomaterialien in vivo beeinflussen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie ein neuartiges Tiermodell bietet, das in vivo Visualisierung und intravitale Analyse von biomaterialassoziierten Infektionen ermöglicht. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Injektion von Mikrosphären aus Biomaterial ein sehr heikles Verfahren ist.
Um eine rein bakterielle Suspension zu erzeugen, übertragen Sie zunächst vier bis fünf Kolonien des fluoreszierenden Staph aureus mCherry-Stamms, kultiviert auf tryptischen Soja-Agrarplatten, ergänzt mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Chloramphenicol, in 10 Milliliter Tryptic-Sojabrühe, ergänzt mit Chloramphenicol, für wachstum in der mittellogarithmischen Wachstumsphase bei 37 Grad Celsius. Wenn die Kultur eine optische Dichtemessung bei 620 Nanometern von 0,4 bis 0,8 erreicht, sammeln Sie die Bakterien durch Zentrifugation und waschen Sie die Zellen zweimal mit einem Milliliter steriler PBS pro Wäsche. Nach der zweiten Wäsche das Pellet in 1,1 Milliliter PVP wieder aufsetzen und die bakterielle Suspension wirbeln, bevor Sie die optische Dichte erneut messen.
Passen Sie dann die Konzentration der bakteriellen Suspension mit PVP entsprechend den experimentellen Anforderungen an, um die reine Bakteriensuspension zu erzeugen. Um eine Bakterien-Mikrosphäresuspension zu erzeugen, Zentrifugen kommerzielle Polystyrol-Mikrosphären, PS-10, und resuspendieren die Mikrosphäre Pellet in der Bakterien-only Suspension. Verdünnen Sie die Bakterien Mikrosphäre Suspension mit einem 1/2 Volumen von PVP, um eine angemessene Konzentration von Bakterien in der Suspension zu erreichen, die etwa 2/3 der in der Bakterien-only Suspension ist.
Mischen Sie die Suspension durch Wirbel. Um die Konzentration der reinen Bakterien- und Bakterienmikrosphärensuspension zu überprüfen, fügen Sie 100 Mikroliter jeder Suspension in einzelne Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu. 10 Mikroliter Aliquots der Suspensionen in 90 Mikrolitersterilen PBS in nachfolgenden Brunnen unter Verwendung von frischen Spitzen für jeden Verdünnungsschritt seriell verdünnen.
Doppelte 10-Mikroliter-Aliquots der unverdünnten und verdünnten bakteriellen Suspensionen auf Agarplatten auftragen und die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius bebrüten. Am nächsten Morgen zählen Sie die Kolonien, um die Anzahl der Bakterien innerhalb der vorbereiteten Bakterien-only und Bakterien Mikrosphäre Suspensionen zu berechnen. Nach dem Sammeln der Zebrafisch-Embryonen entsorgen Sie alle nicht transparenten nicht lebensfähigen Embryonen und brüten etwa 60 Embryonen pro 100-Milliliter Petrischale bei 28 Grad Celsius in frischem E3-Medium.
Nach der Anästhesie, Sequestrieren Sie die GFP-positiven Embryonen für die Fluoreszenzmikroskopie. Übertragen Sie sie auf eine 100-Milliliter Petrischale von E3 Medium. Um eine Spritzgussform zu erstellen, füllen Sie eine 100-Milliliter Petrischale mit einer bis 1,5% flüssigen Agarose.
Verwenden Sie eine Kunststoffformschablone, um Nuten in der Agarose zu erstellen. Wenn die Agarose erstarrt ist, entfernen Sie die Form und bedecken Sie den Agar mit E3 Medium, das mit 0,02% Tricain ergänzt wird. Eines Tages drei Nachdüngung, verwenden Zange, um die Spitze einer gezogenen Glas Mikrokapillarnadel zu brechen, um Spitzen mit einem etwa 20 Mikrometer Außendurchmesser unter einem Lichtmikroskop mit einem Schuppenbalken im Okular zu erreichen.
Die Einstellung der Öffnung der Nadelspitze ist praktisch für die Injektion von Mikrosphären. Der Durchmesser der Öffnung muss für Mikrosphären unterschiedlicher Größe angepasst werden. Dann verwenden Sie eine Microloader Pipettenspitze, um die Nadel mit etwa 20 Mikroliter der Bakterien-Mikrosphäre oder Bakterien-nur Suspension zu laden, und montieren Sie die Nadel auf einem Mikromanipulator mit einem Mikroinjektor verbunden.
Nun die ausgewählten Embryonen auf die gerillte Agaroseplatte übertragen. Nachdem Sie fünf Minuten auf die Anästhesie der Embryonen gewartet haben, richten Sie die Embryonen innerhalb der Rillen in einer einzigen Ausrichtung für ihre Injektion aus. Stellen Sie den Mikroinjektor auf die entsprechenden Injektionseinstellungen ein, und legen Sie die Nadel in das Muskelgewebe des ersten Embryos in einem 45- bis 60-Grad-Winkel unter einem Stereomikroskop ein.
Bewegen Sie die Nadel vorsichtig hin und her, um die Position im Gewebe bei Bedarf anzupassen, und verwenden Sie das Mikroinjektor-Fußpedal, um die geladene Suspension zu injizieren. Bei der Injektion einer Bakterienmikrosphäre Suspension in das Gewebe von Zebrafisch Embryonen, sollte die Nadel sanft, aber mit einer ruhigen Hand eingesetzt werden. Nach einem erfolgreichen Einsetzen sollte vor der Injektion ein Leerzeichen für die Materialien geschaffen werden.
Wenn alle Embryonen injiziert wurden, punkten Sie die Embryonen für eine erfolgreiche Injektion unter einem Stereofluoreszenzmikroskop und halten Sie die Embryonen in E3-Medium ohne Tricain in einzelnen Brunnen von 48-Well-Platten mit täglichen mittleren Veränderungen. Um das Fortschreiten der Infektion durch quantifizierende Einheit zu überwachen, übertragen Sie fünf bis sechs lebensfähige infizierte Embryonen kurz nach der Injektion nach dem Zufallsprinzip in einzelne Zwei-Milliliter-Mikroröhren und waschen Sie die Embryonen vorsichtig mit sterilem PBS. Nach dem Entsorgen der Waschungen 100 Mikroliter steriler PBS in jedes Rohr geben, gefolgt von zwei bis drei sterilen Zirkoniaperlen mit zwei Millimetern Durchmesser.
Dann zerkleinern Sie die Embryonen in einem Homogenisator bei 3 500 Rpm für 30 Sekunden, und kulturieren Sie das Homogenat, wie gezeigt. Legen Sie eine 100-Millimeter-Petrischale mit E3-Medium, ergänzt mit 0,02%Tricain, auf eine Stereofluoreszenzmikroskopstufe und fügen Sie der Petrischale 500 Mikroliter 2%Methylcellulose hinzu. Um den Infektionsfortschritt durch Fluoreszenzmikroskopie zu überwachen, die entsprechenden Hellfeld- und Fluoreszenzfilter auszustatten, richten Sie die anästherisierten infizierten Embryonen horizontal an einem Punkt von Methylcellulose in einer Petrischale aus.
Verwenden Sie den Hellfeldfilter, um das beschädigte injizierte Gewebe bei einer 160-fachen Vergrößerung in den Fokus zu rücken. Stellen Sie die Z-Stack-Tiefe auf 10 Mikrometer und die Schrittgröße auf fünf Mikrometer ein, um die Aufnahme von drei aufeinanderfolgenden Bildern zu ermöglichen. Dann stellen Sie die einzelnen Embryonen unter identisch optimierten Einstellungen bei einer 160-fachen Vergrößerung ab.
Verwenden Sie das ObjectJ-Plugin in ImageJ, um die Bilder zu analysieren. Die intramuskuläre Injektion von Staph aureus leitet eine dosisabhängige Infektion bei Embryonen ein, wobei die lebensfähige Infektionsprogression bei Embryonen beobachtet wird, die an den Tagen eins und zwei nach der Injektion hohe Herausforderungen verabreicht haben. Wie gezeigt, ist es möglich, eine ähnliche Anzahl von Bakterien in Gegenwart oder Abwesenheit von Mikrosphären zu injizieren.
Typischerweise sind alle Embryonen mit mehr als 20 koloniebildenden Einheiten von Staph aureus mCherry positiv für die Fluoreszenz unter mikroskopischer Bewertung, obwohl das Vorhandensein von Mikrosphären das Infektionsverlauf in den niedrig dosierten herausgeforderten Embryonen nicht signifikant zu beeinflussen scheint. Bei hochdosierten herausgeforderten Embryonen zeigt die mikroskopische Bewertung keine Unterschiede in der infizierten Embryohäufigkeit mit oder ohne Mikrosphären, aber die quantitative Kultur zeigt höhere koloniebildende Einheitenzahlen, die von Embryonen in der Staph aureus plus Mikrosphärengruppe abgerufen wurden, verglichen mit denen, die nach der Injektion von der Staph aureus-only-Gruppe geerntet wurden. Das Vorhandensein eines Biomaterials beeinflusst sowohl die Immunzellreaktion als auch die anfängliche Anfälligkeit für Infektionen.
Zum Beispiel ist die Makrophageninfiltration als Reaktion auf eine Staph-Aureus-Injektion nach fünf Stunden nach der Injektion signifikant höher als als als Reaktion auf eine Staph aureus plus Mikrosphären-Injektion, während die Embryonen mit Mikrosphären an einem Tag nach der Injektion eine signifikant höhere Staph-Aureus-Infektion aufweisen als die Embryonen ohne Mikrosphären. Es ist wichtig, daran zu denken, immer die Öffnung der Nadelspitze an die Größe der Biomaterialien anzupassen und das Verhältnis der Bakterienkonzentration in der Bakteriensuspension und der Bakterienmikrosphäre n. B. anzupassen. Dieses Zebrafisch-Embryomodell ermöglicht die In-vivo-Visualisierung und intravitale Analyse des Infektionsverlaufs und der provozierten Immunzellreaktionen in Gegenwart und Abwesenheit von Biomaterialien.
Diese Technik bietet ein neues Ganztiermodell für die Entwicklung antimikrobieller Biomaterialien und Behandlungsstrategien für sichere Medizinprodukte.
