Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo los biomateriales influyen en la susceptibilidad a la infección, cómo influyen en la progresión de tales infecciones y cómo afectan el comportamiento de las células inmunitarias alrededor de estos biomateriales in vivo. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un nuevo modelo animal que permite la visualización in vivo y el análisis intravital de infecciones asociadas a biomateriales. La demostración visual de este método es fundamental ya que la inyección de microesferas biomateriales es un procedimiento muy delicado.
Para generar una suspensión solo para bacterias, primero transfiera de cuatro a cinco colonias de la cepa fluorescente Staph aurery mCherry, cultivada en placas de cultivo de soja trípticas complementadas con 10 microgramos por mililitro de cloramphenicol en 10 mililitros de caldo de soja tríptico complementado con cloramphenicol, para el crecimiento en la fase de crecimiento medio logarítmico a 37 grados Celsius con temblor. Cuando el cultivo alcanza una medida de densidad óptica a 620 nanómetros de 0,4 a 0,8, recoger las bacterias por centrifugación, y lavar las células dos veces con un mililitro de PBS estéril por lavado. Después del segundo lavado, resuspender el pellet en 1,1 mililitros de PVP, y vórtice la suspensión bacteriana antes de medir la densidad óptica de nuevo.
A continuación, ajuste la concentración de la suspensión bacteriana con PVP de acuerdo con los requisitos experimentales para generar la suspensión sólo bacteriana. Para generar una suspensión de microesfera bacteriana, centrifugar microesferas comerciales de poliestireno, PS-10, y resuspender el pellet de microesfera en la suspensión solo bacteriana. Diluir la suspensión de microesfera de la bacteria con un volumen de 1/2 de PVP para alcanzar una concentración adecuada de bacterias en la suspensión que es aproximadamente 2/3 de la que en la suspensión sólo por bacterias.
Mezclar la suspensión por vórtice. Para comprobar la concentración de la suspensión de microesfera solo bacteriana y de bacterias, agregue 100 microlitros de cada suspensión a los pozos individuales de una placa de 96 pozos. Diluir en serie 10 microlitros alícuotas de las suspensiones en 90 microlitros de PBS estériles en pozos posteriores, utilizando puntas frescas para cada paso de dilución.
Aplicar alícuotas duplicadas de 10 microlitros de las suspensiones bacterianas no diluidas y diluidas en las placas de agar, e incubar las placas durante la noche a 37 grados centígrados. A la mañana siguiente, cuente las colonias para calcular el número de bacterias dentro de las suspensiones de microesferas de bacterias y solo preparadas. Después de recoger los embriones de pez cebra, deseche los embriones inviables no transparentes e incubar aproximadamente 60 embriones por plato de Petri de 100 mililitros a 28 grados centígrados en medio E3 fresco.
Después de la anestesia, secuestre los embriones positivos de la GFP para la microscopía de fluorescencia. Transfiéralos a un plato Petri de 100 mililitros de medio E3. Para crear un molde de inyección, llene un plato de Petri de 100 mililitros con una agarosa líquida de uno a 1,5%.
Utilice una plantilla de molde de plástico para crear ranuras en la agarosa. Cuando la agaria se haya solidificado, retire el molde y cubra el agar con medio E3 complementado con 0,02% de tricaína. Un día tres después de la fertilización, utilice fórceps para romper la punta de una aguja microcapilar de vidrio tirado para lograr puntas con un diámetro exterior de aproximadamente 20 micrómetros bajo un microscopio de luz con una barra de escala en el ocular.
El ajuste de la abertura de la punta de la aguja es práctico para la inyección de microesferas. El diámetro de la abertura debe ajustarse para microesferas de diferentes tamaños. A continuación, utilice una punta de pipeta Microloader para cargar la aguja con aproximadamente 20 microlitros de la microesfera bacteriana o suspensión solo bacteriana, y monte la aguja en un micromaniprulador conectado a un microinyector.
Ahora transfiera los embriones seleccionados a la placa de agarosa ranurada. Después de esperar cinco minutos para que los embriones sean anestesiados, alinee los embriones dentro de las ranuras en una sola orientación para su inyección. Ajuste el microinyector a los ajustes de inyección adecuados e inserte la aguja en el tejido muscular del primer embrión en un ángulo de 45 a 60 grados bajo un microscopio estéreo.
Mueva suavemente la aguja hacia adelante y hacia atrás para ajustar la posición dentro del tejido según sea necesario, y utilice el pedal del microinyector para inyectar la suspensión cargada. Al inyectar una suspensión de microesfera bacteriana en el tejido de embriones de pez cebra, la aguja debe insertarse suavemente pero con una mano firme. Después de una inserción exitosa, se debe crear un espacio para los materiales antes de la inyección.
Cuando se hayan inyectado todos los embriones, puntúe los embriones para una inyección exitosa bajo un microscopio de fluorescencia estéreo, y mantenga los embriones en medio E3 sin tricaína en pozos individuales de placas de 48 pozos con cambios medios diarios. Para monitorear la progresión de la infección mediante la cuantificación de la unidad formadora de colonias, transfiera aleatoriamente de cinco a seis embriones infectados viables a microtubos individuales de dos mililitros poco después de la inyección, y lave suavemente los embriones con PBS estéril. Después de desechar los lavados, agregue 100 microlitros de PBS estéril a cada tubo, seguido de dos a tres cuentas estériles de circonio de dos milímetros de diámetro.
A continuación, aplastar los embriones en un homogeneizador a 3.500 rpm durante 30 segundos, y cultivar el homogeneización como se demuestra. Coloque un plato Petri de 100 milímetros que contenga un medio E3 complementado con 0,02% de tricaína en una etapa de microscopio de fluorescencia estéreo, y agregue 500 microlitros de 2% de metilcelulosa en la placa Petri. Para monitorear el progreso de la infección por microscopía de fluorescencia, equipar los filtros fluorescentes y de campo brillante apropiados, alinear los embriones infectados anestesiados horizontalmente en un punto de metilcelulosa en una placa Petri.
Utilice el filtro de campo brillante para enfocar el tejido inyectado dañado en un aumento de 160x. Establezca la profundidad de la pila Z en 10 micrómetros y el tamaño del paso a cinco micrómetros para permitir la grabación de tres imágenes consecutivas. A continuación, imagine los embriones individuales bajo ajustes optimizados idénticos con un aumento de 160x.
Utilice el plugin ObjectJ en ImageJ para analizar las imágenes. La inyección intramuscular de estafilococo inicia una infección dependiente de la dosis en embriones, con progresión de la infección viable observada en embriones administrados dosis de alto desafío en los días uno y dos después de la inyección. Como se ha demostrado, es posible inyectar un número similar de bacterias en presencia o ausencia de microesferas.
Típicamente, todos los embriones con más de 20 unidades formadoras de colonias de Staph aureus mCherry son positivos para la fluorescencia bajo puntuación microscópica, aunque la presencia de microesferas parece no influir significativamente en la progresión de la infección en los embriones de dosis bajas cuestionados. En embriones con alto costo, la puntuación microscópica no demuestra ninguna diferencia en la frecuencia de embriones infectados con o sin microesferas, pero el cultivo cuantitativo revela números más altos de unidades formadoras de colonias recuperados de embriones en el grupo Staph aureus plus microsphere en comparación con los cosechados del grupo Staph aureus a los dos días posteriores a la inyección. La presencia de un biomaterial influye tanto en la respuesta de las células inmunitarias como en la susceptibilidad inicial a la infección.
Por ejemplo, a las cinco horas después de la inyección, la infiltración de macrófagos en respuesta a una inyección sólo staf aureus es significativamente mayor que en respuesta a una inyección de Staph aureus más microesferas, mientras que en un día después de la inyección, los embriones con microesferas presentan niveles significativamente más altos de infección por Staph aureus que los embriones sin microesferas. Es importante recordar ajustar siempre la abertura de la punta de la aguja al tamaño de los biomateriales y ajustar la relación de la concentración de bacterias en la suspensión solo bacteriana y la suspensión de microesfera de las bacterias. Este modelo de embrión de pez cebra permite la visualización in vivo y el análisis intravital de la progresión de la infección y las respuestas de células inmunitarias provocadas en presencia y ausencia de biomateriales.
Esta técnica proporciona un nuevo modelo de animales enteros para el desarrollo de biomateriales antimicrobianos y estrategias de tratamiento para dispositivos médicos seguros.
