이 방법은 생체 재료가 감염에 대한 감수성에 미치는 영향, 그러한 감염의 진행에 미치는 영향 및 생체 내 생체 재료 주변의 면역 세포 행동에 미치는 영향에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 생체 재료 관련 감염의 생체 시각화 및 인트라테생 분석을 허용하는 새로운 동물 모델을 제공한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 데모는 생물 물질 미세 구의 주입이 매우 섬세한 절차이기 때문에 중요합니다.
박테리아 전용 현탁액을 생성하기 위해, 먼저 형광 Staph aureus mCherry 균주의 4 ~ 5 개의 식민지를 전송, 클로람페니콜의 밀리리터 당 10 마이크로 그램으로 보충 트립틱 콩 농업 플레이트에 배양 10 트립틱 콩 국물의 밀리리터, 클로람페니콜으로 보충, 중반 로그증 에서 성장을 위해 37. 배양시 0.4 내지 0.8의 620 나노미터에서 광학 밀도 측정에 도달하면 원심분리에 의해 박테리아를 수집하고 세척당 멸균 PBS 1밀리리터로 세포를 두 번 세척한다. 두 번째 세척 후, PVP의 1.1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 다시 광학 밀도를 측정하기 전에 세균 현탁액을 소용돌이.
그런 다음 박테리아 전용 현탁액을 생성하는 실험 적 요구 사항에 따라 PVP로 세균 현탁액의 농도를 조정합니다. 박테리아 마이크로스피어 서스펜션을 생성하기 위해, 원심분리기 상용 폴리스티렌 마이크로스피어, PS-10, 세균 전용 현탁액에서 마이크로스피어 펠릿을 재일시 중단한다. 박테리아 마이크로스피어 현탁액을 1/2 부피의 PVP로 희석하여 박테리아 전용 현탁액에서 약 2/3인 현탁액내의 적절한 박테리아 농도에 도달한다.
소용돌이에 의해 서스펜션을 혼합합니다. 박테리아 전용 및 박테리아 마이크로스피어 서스펜션의 농도를 확인하려면 각 현탁액의 100 마이크로리터를 96웰 플레이트의 개별 우물에 추가합니다. 각 희석 단계에 대한 신선한 팁을 사용하여 연속적으로 90 마이크로 리터의 멸균 PBS의 90 마이크로 리터에 서스펜션의 10 마이크로 리터 알리쿼트희석.
희석되지 않은 희석된 세균 현탁액의 복제된 10 마이크로리터 알리쿼트를 한천 접시에 바르고 밤새 플레이트를 섭씨 37도에서 배양합니다. 다음 아침, 식민지를 계산하여 준비된 박테리아 전용 및 박테리아 마이크로스피어 현탁액 내에서 박테리아의 수를 계산합니다. 제브라피쉬 배아를 수집한 후, 투명하지 않은 태아를 버리고 신선한 E3 배지에서 섭씨 28도에서 100밀리리터 페트리 접시당 약 60개의 배아를 배양합니다.
마취 후 형광 현미경 검사법을 위한 GFP 양성 배아를 격리합니다. E3 매체의 100밀리리터 페트리 디쉬로 옮기. 사출 금형을 만들려면 100 밀리리터 페트리 접시를 1~1.5%의 액체 아가로즈로 채웁니다.
플라스틱 금형 템플릿을 사용하여 아가로즈에 홈을 만듭니다. 아가로즈가 고화되면 금형을 제거하고 0.02%의 트리카인으로 보충된 E3 배지로 한고를 덮습니다. 어느 날 3 후 수정, 안구에 스케일 바가있는 가벼운 현미경으로 약 20 마이크로 미터 외부 직경으로 팁을 달성하기 위해 당겨진 유리 미세 모세관 바늘의 끝을 깰 집게를 사용합니다.
바늘 끝의 개구를 조정하는 것은 마이크로스피어의 주입에 용이합니다. 개구의 직경은 다른 크기의 미세 구체에 대해 조정되어야합니다. 그런 다음 마이크로로더 파이펫 팁을 사용하여 박테리아 마이크로스피어 또는 박테리아 전용 현탁액의 약 20 마이크로리터로 바늘을 적재하고 마이크로 인젝터에 연결된 미세 조작기에 바늘을 장착합니다.
이제 선택한 배아를 홈아가로즈 플레이트로 옮겨놓습니다. 태아가 마취될 때까지 5분을 기다린 후, 주사를 위한 단일 방향으로 홈 내의 배아를 정렬합니다. 미세 인젝터를 적절한 주입 설정으로 설정하고 스테레오 현미경하에서 45 ~ 60도 각도로 첫 번째 배아의 근육 조직에 바늘을 삽입합니다.
바늘을 앞뒤로 부드럽게 움직여 필요에 따라 조직 내의 위치를 조정하고 마이크로인젝터 풋 페달을 사용하여 로드된 서스펜션을 주입합니다. 제브라피시 배아 의 조직에 박테리아 마이크로 스피어 현탁액을 주입 할 때, 바늘은 부드럽게 삽입하지만 꾸준한 손으로 삽입해야합니다. 성공적인 삽입 후 주입 전에 재료에 대한 공간을 만들어야 합니다.
모든 배아가 주입되었을 때, 스테레오 형광 현미경의 밑에 성공적인 주입을 위한 배아를 득점하고, 매일 매체 변경을 가진 48웰 플레이트의 개별 우물에서 트리카인 없이 E3 배지에 있는 배아를 유지합니다. 식민지 형성 단위 정량화에 의한 감염 진행을 감시하기 위하여는, 주사 직후 개별 2 밀리리터 마이크로튜브로 5-6개의 실행 가능한 감염된 태아를 무작위로 전송하고, 멸균 PBS로 태아를 부드럽게 세척합니다. 세차장을 폐기한 후 각 튜브에 멸균 PBS 100마이크로리터를 넣고 2~3개의 멸균 2mm 직경지르코니아 구슬을 넣습니다.
그런 다음 30초 동안 3, 500 rpm에서 균질화로 배아를 분쇄하고, 입증된 바와 같이 균주를 배양한다. 스테레오 형광 현미경 단계에 0.02%트리카인으로 보충된 E3 배지를 함유한 100mm 페트리 접시를 넣고, 페트리 접시에 2%메틸셀룰로오스500마이크로리터를 넣습니다. 형광 현미경 검사법에 의한 감염 진행 상황을 모니터링하려면 적절한 밝은 필드 및 형광 필터를 장착하고, 페트리 접시에 메틸 셀룰로오스의 자리에 마취 감염 배아를 수평으로 정렬합니다.
밝은 필드 필터를 사용하여 손상된 주입 된 조직을 160 배율로 초점으로 가져옵니다. Z 스택 깊이를 10 마이크로미터로 설정하고 단계 크기를 5 마이크로미터로 설정하여 3개의 연속 이미지를 기록할 수 있습니다. 그런 다음 160배율로 동일한 최적화된 설정으로 개별 배아를 이미지합니다.
ImageJ에서 ObjectJ 플러그인을 사용하여 이미지를 분석합니다. Staph aureus의 근육 주사는 배아에 있는 복용량 의존적인 감염을 개시합니다, 태아에서 관찰된 실행 가능한 감염 진행과 일 1 및 2 후에 주사 후에 고도전 복용량을 관리합니다. 입증 된 바와 같이, 마이크로 스피어의 존재 또는 부재에서 박테리아의 유사한 수를 주입 할 수있다.
전형적으로, Staph aureus mCherry의 20개 이상의 콜로니 형성 단위를 가진 모든 배아는 현미경 점수하에서 형광에 대해 양성이지만, 마이크로스피어의 존재는 저용량 도전 배아의 감염 진행에 크게 영향을 미치지 않는 것으로 보인다. 고양 된 도전 배아에서, 현미경 점수는 마이크로 스피어의 유무에 관계없이 감염된 배아 주파수에 있는 어떤 다름도 보여주지 않습니다, 그러나 정량적인 배양은 Staph aureus 플러스 마이크로 스피어 단에 있는 배아에서 회수된 더 높은 식민지 형성 단위 수를 제시합니다 2 일 후에 Staph aureus 전용 단에서 수확한 것과 비교됩니다. 생체 물질의 존재는 면역 세포 반응과 감염에 대한 초기 감수성에 영향을 미칩니다.
예를 들어, 주사 후 5시간 에서, 포도상 구레나기 전용 주사에 대한 반응에서 대식세포 침광은 Staph 아우레우스 플러스 마이크로스피어 주입에 대한 반응보다 현저히 높으며, 1일 후 주사시, 마이크로스피어를 가진 배아는 마이크로스피어가 없는 배아보다 훨씬 높은 수준의 Staph aureus 감염을 나타낸다. 항상 바늘 팁의 개구부를 생체 재료의 크기로 조정하고 박테리아 전용 현탁액 및 박테리아 미세구 현탁액에서 박테리아 농도의 비율을 조정하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이러한 제브라피쉬 배아 모델은 생체 재료의 존재 와 부재에서 감염 진행 및 유발 된 면역 세포 반응의 생체 내 시각화 및 인트라비티 분석을 허용합니다.
이 기술은 안전한 의료 기기를 위한 항균 생체 재료 및 치료 전략개발을 위한 새로운 전체 동물 모델을 제공합니다.
