Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave su come i biomateriali influenzano la suscettibilità alle infezioni, come influenzano la progressione di tali infezioni e come influenzano il comportamento delle cellule immunitarie intorno a tali biomateriali in vivo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un nuovo modello animale che consente la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale delle infezioni associate ai biomateriali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto l'iniezione di microsfere di biomateriali è una procedura molto delicata.
Per generare una sospensione solo batterica, prima trasferire da quattro a cinque colonie del ceppo fluorescente Staph aureus mCherry, coltivato su piastre agricole di soia triptica integrate con 10 microgrammi per millilitro di cloramfenicolo in 10 millilitri di brodo di soia triptico integrato con cloramfenicolo, per la crescita nella fase di crescita medio-logaritmica a 37 gradi Celsius con scuotimento. Quando la coltura raggiunge una misurazione della densità ottica a 620 nanometri da 0,4 a 0,8, raccogliere i batteri per centrifugazione e lavare le cellule due volte con un millilitro di PBS sterile per lavaggio. Dopo il secondo lavaggio, rimescolare il pellet in 1,1 millilitri di PVP e vortice la sospensione batterica prima di misurare nuovamente la densità ottica.
Quindi regolare la concentrazione della sospensione batterica con PVP in base ai requisiti sperimentali per generare la sospensione solo batterica. Per generare una sospensione della microsfera batteriche, centrifugare microsfere commerciali di polistirolo, PS-10, e rimescolare il pellet della microsfera nella sospensione solo batteri. Diluire la sospensione della microsfera batteriche con un volume di PVP 1/2 per raggiungere un'appropriata concentrazione di batteri nella sospensione che è circa 2/3 di quella nella sospensione solo batteri.
Mescolare la sospensione con il vortice. Per controllare la concentrazione della sospensione della microsfera batterica e batterica, aggiungere 100 microlitri di ogni sospensione ai singoli pozzi di una piastra da 96 porri. Diluire in serie le aliquote di 10 microlitri delle sospensioni in 90 microlitri di PBS sterile nei pozzi successivi, utilizzando punte fresche per ogni fase di diluizione.
Applicare aliquote duplicate da 10 microliter delle sospensioni batteriche non diluite e diluite sulle piastre di agar e incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius. La mattina seguente, conta le colonie per calcolare il numero di batteri all'interno delle sospensioni della microsfera preparate solo per batteri e batteri. Dopo aver raccolto gli embrioni di zebrafish, scartare eventuali embrioni non trasparenti non trasparenti e incubare circa 60 embrioni per piastra di Petri da 100 millilitri a 28 gradi Celsius in mezzo E3 fresco.
Dopo l'anestesia, sequestri gli embrioni positivi alla GFP per la microscopia a fluorescenza. Trasferirli in una piastra di Petri da 100 millilitri di mezzo E3. Per creare uno stampo a iniezione, riempire una piastra di Petri da 100 millilitri con agarosio liquido da uno all'1,5%.
Utilizzare un modello di stampo in plastica per creare scanalature nell'agarosio. Quando l'agarosio si è solidificato, rimuovere lo stampo e coprire l'agar con mezzo E3 integrato con 0,02%tricaina. Un giorno tre dopo la fecondazione, utilizzare le pinza per rompere la punta di un ago microcapillare di vetro tirato per ottenere punte con un diametro esterno di circa 20 micrometri sotto un microscopio leggero con una barra di scala nell'oculare.
La regolazione dell'apertura della punta dell'ago è pratica per l'iniezione di microsfere. Il diametro dell'apertura deve essere regolato per microsfere di diverse dimensioni. Quindi utilizzare una punta di pipetta Microloader per caricare l'ago con circa 20 microlitri della microsfera batterica o sospensioni solo batterica e montare l'ago su un micromanipolatore collegato a un microiniettore.
Ora trasferisci gli embrioni selezionati nella piastra di agarosio scanalata. Dopo aver aspettato cinque minuti che gli embrioni siano anestetizzati, allineare gli embrioni all'interno delle scanalature in un unico orientamento per la loro iniezione. Impostare il microiniettore sulle impostazioni di iniezione appropriate e inserire l'ago nel tessuto muscolare del primo embrione con un angolo da 45 a 60 gradi al microscopio stereo.
Spostare delicatamente l'ago avanti e indietro per regolare la posizione all'interno del tessuto in base alle esigenze e utilizzare il pedale del piede del microiniettore per iniettare la sospensione caricata. Quando si inietta una sospensione della microsfera batterica nel tessuto degli embrioni di zebrafish, l'ago deve essere inserito delicatamente ma con una mano ferma. Dopo un inserimento riuscito, è necessario creare uno spazio per i materiali prima dell'iniezione.
Quando tutti gli embrioni sono stati iniettati, segnare gli embrioni per un'iniezione riuscita al microscopio a fluorescenza stereo e mantenere gli embrioni in mezzo E3 senza tricaina in singoli pozzi di piastre a 48 pozza con variazioni medie giornaliere. Per monitorare la progressione dell'infezione mediante quantificazione dell'unità di formazione della colonia, trasferire casualmente da cinque a sei embrioni infetti vitali in singoli microtubi da due millilitri poco dopo l'iniezione e lavare delicatamente gli embrioni con PBS sterile. Dopo aver scartato i lavaggi, aggiungere 100 microlitri di PBS sterile a ciascun tubo, seguiti da due o tre perline sterili di zirconia di due millimetri di diametro.
Quindi schiacciare gli embrioni in un omogeneizzatore a 3.500 giri/min per 30 secondi e colturare l'omogeneizzato come dimostrato. Posizionare una piastra di Petri di 100 millimetri contenente mezzo E3 integrato con 0,02% di tricaina su uno stadio stereo al microscopio a fluorescenza e aggiungere 500 microlitri di metilcellulosa al 2% nella piastra di Petri. Per monitorare l'avanzamento dell'infezione mediante microscopia a fluorescenza, equipaggiare i filtri fluorescenti e a campo luminoso appropriati, allineare gli embrioni infetti anestetizzati orizzontalmente in un punto di metilcellulosa in una piastra di Petri.
Utilizzare il filtro a campo luminoso per mettere a fuoco il tessuto iniettato danneggiato con un ingrandimento di 160x. Impostare la profondità dello stack Z a 10 micrometri e la dimensione del passo a cinque micrometri per consentire la registrazione di tre immagini consecutive. Quindi immagini i singoli embrioni con impostazioni ottimizzate identiche con un ingrandimento di 160x.
Utilizzare il plug-in ObjectJ in ImageJ per analizzare le immagini. L'iniezione intramuscolare di Staph aureus avvia un'infezione dose-dipendente negli embrioni, con una progressione dell'infezione praticabile osservata negli embrioni somministrati dosi ad alta sfida nei giorni uno e due dopo l'iniezione. Come dimostrato, è possibile iniettare un numero simile di batteri in presenza o assenza di microsfere.
Tipicamente, tutti gli embrioni con più di 20 unità di formazione di colonie di Staph aureus mCherry sono positivi per la fluorescenza sotto punteggio microscopico, anche se la presenza di microsfere sembra non influenzare significativamente la progressione dell'infezione negli embrioni sfidati a bassa dose. Negli embrioni sfidati ad alte dosi, il punteggio microscopico non dimostra alcuna differenza nella frequenza degli embrioni infetti con o senza microsfere, ma la coltura quantitativa rivela un numero di unità di formazione della colonia più elevato recuperato dagli embrioni nel gruppo Staph aureus più microsfera rispetto a quelli raccolti dal gruppo solo Staph aureus a due giorni dopo l'iniezione. La presenza di un biomateriale influenza sia la risposta delle cellule immunitarie che la suscettibilità iniziale alle infezioni.
Ad esempio, a cinque ore dopo l'iniezione, l'infiltrazione di macrofagi in risposta a un'iniezione solo di Staph aureus è significativamente più alta che in risposta a un'iniezione di Staph aureus più microsfere, mentre a un giorno dopo l'iniezione, gli embrioni con microsfere mostrano livelli significativamente più alti di infezione da Staph aureus rispetto agli embrioni senza microsfere. È importante ricordare di regolare sempre l'apertura della punta dell'ago alle dimensioni dei biomateriali e di regolare il rapporto tra la concentrazione di batteri nella sospensione solo batteri e la sospensione della microsfera batteriche. Questo modello di embrione zebrafish consente la visualizzazione in vivo e l'analisi intravitale della progressione dell'infezione e delle risposte provocate alle cellule immunitarie in presenza e assenza di biomateriali.
Questa tecnica fornisce un nuovo modello interamente animale per lo sviluppo di biomateriali antimicrobici e strategie di trattamento per dispositivi medici sicuri.
