Esse método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre como os biomateriais influenciam a suscetibilidade à infecção, como eles influenciam a progressão dessas infecções e como afetam o comportamento das células imunes em torno desses biomateriais in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece um novo modelo animal que permite visualização in vivo e análise intravital de infecções associadas a biomateriais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a injeção de microesferas biomaterial é um procedimento muito delicado.
Para gerar uma suspensão somente de bactérias, primeiro transfira quatro a cinco colônias da cepa fluorescente Staph aureus mCherry, cultivada em placas de agricultura de soja trippética suplementadas com 10 microgramas por mililitro de clorofenicol em 10 mililitros de caldo de soja tripptic complementado com clororamfenicol, para crescimento na fase de crescimento logarítmico médio em 37 graus Celsius com agitação. Quando a cultura atinge uma medição de densidade óptica a 620 nanômetros de 0,4 a 0,8, colete as bactérias por centrifugação e lave as células duas vezes com um mililitro de PBS estéril por lavagem. Após a segunda lavagem, resuspenja a pelota em 1,1 mililitros de PVP, e vórtice a suspensão bacteriana antes de medir novamente a densidade óptica.
Em seguida, ajuste a concentração da suspensão bacteriana com PVP de acordo com os requisitos experimentais para gerar a suspensão somente de bactérias. Para gerar uma suspensão da microesfera de bactérias, centrífuga microesferas comerciais de poliestireno, PS-10, e resuspensar a pelota da microesfera na suspensão somente de bactérias. Diluir a suspensão da microesfera da bactéria com um volume de 1/2 de PVP para atingir uma concentração adequada de bactérias na suspensão que é aproximadamente 2/3 disso na suspensão somente de bactérias.
Misture a suspensão por vórtice. Para verificar a concentração da suspensão da microesfera somente de bactérias e bactérias, adicione 100 microliters de cada suspensão a poços individuais de uma placa de 96 poços. Diluir em série 10 alíquotas de microliter das suspensões em 90 microliters de PBS estéreis em poços subsequentes, usando novas pontas para cada etapa de diluição.
Aplique alíquotas duplicadas de 10 microliter das suspensões bacterianas não diluídas e diluídas em placas de ágar, e incubar as placas durante a noite a 37 graus Celsius. Na manhã seguinte, conte as colônias para calcular o número de bactérias dentro das suspensões de microesferas preparadas por bactérias e bactérias. Depois de coletar os embriões de zebrafish, descarte quaisquer embriões inviáveis não transparentes e incubar aproximadamente 60 embriões por placa petri de 100 mililitros a 28 graus Celsius em meio E3 fresco.
Após anestesia, sequetre os embriões GFP positivos para microscopia de fluorescência. Transfira-os para uma placa petri de 100 mililitros de meio E3. Para criar um molde de injeção, encha uma placa de Petri de 100 mililitros com uma agarose líquida de 1 a 1,5%.
Use um modelo de molde de plástico para criar ranhuras na ágarose. Quando a agarose tiver solidificado, remova o molde e cubra o ágar com e3 médio suplementado com 0,02%tricina. Um dia três pós-fertilização, use fórceps para quebrar a ponta de uma agulha microcapilar de vidro puxada para obter pontas com um diâmetro externo de aproximadamente 20 micrômetros sob um microscópio leve com uma barra de escala no ocular.
O ajuste da abertura da ponta da agulha é prático para a injeção de microesferas. O diâmetro da abertura precisa ser ajustado para microesferas de diferentes tamanhos. Em seguida, use uma ponta de pipeta microcarregador para carregar a agulha com aproximadamente 20 microliters da microesfera da bactéria ou suspensão somente de bactérias, e montar a agulha em um micromanipulador conectado a um microinjetor.
Agora transfira os embriões selecionados para a placa de agarose ranhurada. Depois de esperar cinco minutos para que os embriões sejam anestesiados, alinhe os embriões dentro das ranhuras em uma única orientação para sua injeção. Coloque o microinjetor nas configurações de injeção apropriadas e insira a agulha no tecido muscular do primeiro embrião em um ângulo de 45 a 60 graus sob um microscópio estéreo.
Mova suavemente a agulha para frente e para trás para ajustar a posição dentro do tecido conforme necessário, e use o pedal do pé microinjetor para injetar a suspensão carregada. Ao injetar uma suspensão da microesfera de bactérias no tecido de embriões de zebrafish, a agulha deve ser inserida suavemente, mas com uma mão firme. Após uma inserção bem sucedida, um espaço deve ser criado para os materiais antes da injeção.
Quando todos os embriões forem injetados, marque os embriões para uma injeção bem sucedida sob um microscópio de fluorescência estéreo, e mantenha os embriões no meio E3 sem tricaine em poços individuais de 48 placas de 48 poços com alterações médias diárias. Para monitorar a progressão da infecção por quantificação de unidade formadora de colônias, transfira aleatoriamente cinco a seis embriões infectados viáveis em microtubos individuais de dois mililitros logo após a injeção, e lave suavemente os embriões com PBS estéril. Após descartar as lavagens, adicione 100 microlitadores de PBS estéreis a cada tubo, seguido por duas a três contas de zircônia estéreis de dois milímetros de diâmetro.
Em seguida, esmague os embriões em um homogeneizador a 3.500 rpm por 30 segundos, e cultural o homogeneizar como demonstrado. Coloque uma placa de Petri de 100 milímetros contendo e3 médio suplementado com 0,02% de tricaine em um estágio de microscópio de fluorescência estéreo, e adicione 500 microlitros de 2%de metilcelulose na placa de Petri. Para monitorar o progresso da infecção por microscopia de fluorescência, equipar os filtros de campo brilhante e fluorescentes apropriados, alinhe os embriões infectados anestesiados horizontalmente em uma mancha de metilcelulose em uma placa de Petri.
Use o filtro de campo brilhante para colocar o tecido injetado danificado em foco em uma ampliação de 160x. Ajuste a profundidade da pilha Z em 10 micrômetros e o tamanho da etapa em cinco micrômetros para permitir a gravação de três imagens consecutivas. Em seguida, imagem os embriões individuais em configurações otimizadas idênticas em uma ampliação de 160x.
Use o plugin ObjectJ no ImageJ para analisar as imagens. A injeção intramuscular de Staph aureus inicia uma infecção dependente de dose em embriões, com progressão viável de infecção observada em embriões administrados doses de alto desafio nos dias um e dois pós-injeção. Como demonstrado, é possível injetar números semelhantes de bactérias na presença ou ausência de microesferas.
Normalmente, todos os embriões com mais de 20 unidades formadoras de colônias de Staph aureus mCherry são positivos para fluorescência sob pontuação microscópica, embora a presença de microesferas pareça não influenciar significativamente a progressão da infecção nos embriões desafiados de baixa dose. Em embriões desafiados de alta dosagem, a pontuação microscópica não demonstra diferenças na frequência de embriões infectados com ou sem microesferas, mas a cultura quantitativa revela maior número de unidades formadoras de colônias recuperadas de embriões no grupo Staph aureus plus microesfera em comparação com os colhidos do grupo só de Staph aureus em dois dias após a injeção. A presença de um bioma material influencia tanto a resposta das células imunes quanto a suscetibilidade inicial à infecção.
Por exemplo, em cinco horas após a injeção, a infiltração do macrófago em resposta a uma injeção só de staph aureus é significativamente maior do que em resposta a uma injeção de estafa mais microesferas, enquanto em um dia pós-injeção, os embriões com microesferas exibem níveis significativamente mais altos de infecção por Estafilococos do que os embriões sem microesferas. É importante lembrar sempre ajustar a abertura da ponta da agulha para o tamanho dos biomateriais e ajustar a proporção da concentração de bactérias na suspensão somente de bactérias e suspensão da microesfera das bactérias. Este modelo de embrião de zebrafish permite a visualização in vivo e a análise intravital da progressão da infecção e as respostas provocadas das células imunes na presença e ausência de biomateriais.
Esta técnica fornece um novo modelo de animais inteiros para o desenvolvimento de biomateriais antimicrobianos e estratégias de tratamento para dispositivos médicos seguros.
