Tau蛋白在自身组装中误入成对的脂肪丝是阿尔茨海默病和其他陶氏病的病理特征。在这里，我们提出了一个强大的Tau聚合分析，可以帮助阐明Tau发病机制的过程。转化遵循成核依赖聚合过程的所有步骤，具有高度可重复性，允许以迄今为止符合 OBSI 水平的更严格格式进行药物筛选。
试剂的质量至关重要。重组陶需要高度纯净，没有聚合和碎片。首先打开计算机和多模微孔板读卡器。
允许设备稳定后，启动软件并选择标准协议作为协议类型。将温度设置为 37 摄氏度，并选择预热，然后再继续执行协议。接下来，将动能运行时间设置为 50 小时，将测量间隔设置为 15 分钟。
在连续模式下将轨道震动设置为每分钟 425 次。在此之后，选择读取方法作为荧光强度端点动能器。将激发波长设置为 440 纳米，将发射波长设置为 485 纳米，将光学位置设置为顶部，将增益设置为 80。
选择正常读取速度，将读取高度设置为 4.50 毫米。然后验证并保存协议。使用创建的协议开始运行。
命名实验，选择新创建文件的目标，并允许仪器预平衡到所需的温度。对于自发重组 Tau 转化实验，制备 1000 微升反应样本，其中 800 微升用于硫黄素-T 荧光，130 微升用于 SEC-MALS 分析，首先将蛋白质与 1.5 毫升管中的反应缓冲液混合。然后加入肝素和硫黄素-T，通过上下移液五次混合良好。
必须精确执行协议，以确保高可重复性，按相同顺序混合试剂，并在时间范围内保持。在 12，000 x g 和 25 摄氏度下旋转样品 5 分钟，以消除气泡。离心后，每孔在96孔微孔板中分配200微升反应样品，避免气泡的形成。
然后密封微孔板以避免蒸发。将微孔板放在多模微孔板读卡器中。选择全板，或者如果板未满，请选择要读取的孔，然后开始测量。
将数据导出到数据处理软件。然后从设备中卸下微孔板。接下来，从微孔板上拆下密封器。
通过上下移液两次混合井中聚合的样品，将不同的样品混合在1.5毫升管中。通过上下移液五次彻底混合每个样品，并在云母表面分配 10 到 20 微升，通过原子力显微镜分析聚合。之后，在20，000 x g和4摄氏度的温度下旋转每根1.5毫升管，收获集料，一小时。
通过 SEC-MALS 分析上一液，以确认样本中不存在单体 Tau，表明成功转换为聚合体。接下来，去除所有剩余的上清液，并标记含有剩余集料的1.5毫升管与初始重组Tau蛋白浓度和样品量。捕捉冻结集料并储存在 80 摄氏度。
对于种子实验，从冰柜中取出重组的Tau集料，添加标签上指示的反应缓冲液量，使管子稳定到室温。然后通过上下移液五到八次来重新暂停聚合。使用 1/8 英寸微提示在冰上对 200 微升聚合样品进行声波处理，总周期为 15 秒，脉冲在 30% 的振幅下脉冲为 1 秒，关闭两秒。
接下来，准备一个800微升的反应样品，首先将蛋白质与反应缓冲液混合在1.5毫升管中。然后加入肝素和硫黄素-T，通过上下移液五次混合良好。在 12，000 x g 和 25 摄氏度下旋转样品 5 分钟，以消除气泡。
离心后，在96孔微孔板中每孔分配198微升反应样品，避免气泡的形成。通过上下移液三次，使预制纤维样品均质。将与所需种子百分比对应的量添加到每井中，然后通过上下移液三次混合。
然后密封微孔板以避免蒸发。将微孔板放在多模微孔板读卡器中并开始测量。实验完成后，从设备中取下微孔板。
然后将数据导出到电子表格。包含 C291A 和 C322A 突变和 n 终端的 Tau 和 n 终端 c 标记在 SDS 页面上非常纯净，并且几乎 100% 单体，由 SEC-MALS 评估。肝素诱导重组Tau聚集后，使用440纳米的激发波长和485纳米的发射波长，随后是硫黄素-T荧光。
该测定是高度可重复的，10个单独油井的结果几乎无法区分。重组陶聚合体是不同长度的纤维结构的同质混合物，类似于报告的外体形态。最终反应混合物不含单体，建议完全转化为聚合体，如 SEC-MALS 测量所示。
在独立实验运行中重组Tau聚合的动力学相似，相似的西格莫德曲线和无法区分的滞后和生长阶段都强调了这一点。当使用不同批次的蛋白质时，可重复性水平保持高。预制重组陶集料在招募陶单体和诱导形成新陶集料方面是有效的，并且过程的效率与种子的百分比成正比。
以体积表示的预成型 Tau 聚合值中低至 0.0025% 的量能够绕过重组 Tau 成核并触发 de novo fibral 生成。目前的检测模拟了陶氏体内的误折叠和聚合，使机械研究能够揭示发病机制过程，构成药物筛选和研究药物候选者对过程不同阶段的干扰的宝贵工具。测定的高可重复性将使科学家能够相对容易地在实验室中实施它。
虽然目前的测定只侧重于最长的Tau等同形式，人类Tau-441，该应用可以适应研究不同的Tau变种。不要忘记，选择正确的蛋白质试剂，并生产出高质量的标准，对于建立一个强大和高度可重复的检测至关重要。
