Tau proteininin kendi kendine birleşmesinde eşleştirilmiş sarmal filamentlere yanlış bağlanması Alzheimer hastalığı ve diğer Tauopatilerin patolojik bir özelliğidir. Burada Tau patogenezi sürecini açıklığa kavuşturabilecek sağlam bir Tau toplama analizi salıyoruz. Dönüştürme, çekirdekleşmeye bağımlı polimerizasyon sürecinin tüm adımlarını takip eder ve son derece tekrarlanabilir olup, bugüne kadar OBSI seviyesini karşılayan daha titiz bir biçimde ilaç taramasına olanak sağlar.
Reaktiflerin kalitesi çok önemlidir. Rekombinant Tau'nun son derece saf ve agregalardan ve parçalardan yoksun olması gerekir. İlk bilgisayar ve çok modlu mikroplaka okuyucu açın.
Ekipmanın stabilize etmesine izin vererek, yazılımı başlatın ve protokol türü olarak Standart Protokol'ün Sıcaklığı 37 dereceye ayarlayın ve protokolü devam etmeden önce Ön IsıtMa'yı seçin. Ardından, kinetik çalışma süresini 50 saate, ölçüm aralığını ise 15 dakikaya ayarlayın.
Sürekli modda dakikada 425 döngüleri orbital sallayarak ayarlayın. Bunu takiben, floresan yoğunluğu uç nokta kinetik momochromators olarak okuma yöntemini seçin. Uyarma dalga uzunluğunu 440 nanometreye, emisyon dalga boyunu 485 nanometreye, optik konumunu en üste ve kazancı 80'e ayarlayın.
Normal okuma hızını seçin ve okuma yüksekliğini 4,50 milimetreye ayarlayın. Sonra protokolü doğrulayın ve kaydedin. Oluşturulan protokolü kullanarak çalıştırmayı başlatın.
Denemenin adını verin, yeni oluşturulan dosyanın hedefini seçin ve enstrümanın istenilen sıcaklıkta önceden dengede bulunmasına izin verin. Spontan rekombinant Tau dönüşüm deneyi için, thioflavin-T floresan için 800 mikrolitre, SEC-MALS analizi için 130 mikrolitre lik bir reaksiyon numunesi hazırlayın ve proteini 1,5 mililitrelik bir tüpteki reaksiyon tamponuyla karıştırın. Sonra heparin ve thioflavin-T ekleyin ve yukarı ve aşağı beş kez pipetting tarafından iyice karıştırın.
Yüksek tekrarlanabilirlik sağlamak, reaktifleri aynı sırada karıştırmak ve zaman dilimleri içinde tutmak için protokolü tam olarak yürütmek önemlidir. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için numuneyi 12, 000 x g ve 25 santigrat derecede beş dakika döndürün. Ardından santrifüj, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyerek, 96 kuyulu bir mikroplaka içinde kuyu başına 200 mikrolitre reaksiyon numunesi dağıtın.
Sonra buharlaşmayı önlemek için mikroplaka mühür. Mikro plakayı çok modlu bir mikroplaka okuyucuya yerleştirin. Tam plakayı seçin veya plaka dolu değilse okunacak kuyuları seçin ve ölçümü başlatın.
Verileri veri işleme yazılımına dışa aktarın. Daha sonra mikroplakayı ekipmandan çıkarın. Daha sonra, mikroplakadan masubirleyiciçıkarın.
Toplam numuneyi iki kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak kuyularda karıştırın ve farklı kopyaları 1,5 mililitrelik tüplerde birleştirin. Her numuneyi beş kez yukarı ve aşağı borular oluşturarak iyice karıştırın ve atomik kuvvet mikroskobu ile agregaları analiz etmek için mika yüzeyine 10 ila 20 mikrolitre dağıtın. Bunu takiben, 20, 000 x g ve 4 santigrat derece bir saat için her biri 1.5 mililitrelik tüp iplik tarafından agregalar hasat.
Örnekte monomerik Tau'nun yokluğunu doğrulamak için SEC-MALS tarafından supernatant'ı analiz edin ve bu da agregalara başarılı bir dönüşüm olduğunu gösterir. Daha sonra, kalan tüm supernatant'ı çıkarın ve kalan agregaları içeren 1,5 mililitrelik tüpü ilk rekombinant Tau protein konsantrasyonu ve numune hacmi ile etiketlendirin. Snap agregaları dondurun ve 80 santigrat derecede saklayın.
Tohumlu bir deney için, rekombinant Tau agregalarını dondurucudan çıkarın, etikette belirtilen reaksiyon arabelleği hacmini ekleyin ve tüpün oda sıcaklığına sabitlenmesine izin verin. Daha sonra yukarı ve aşağı beş ila sekiz kez pipetleme tarafından agregalar yeniden askıya alın. 200 mikrolitrelik toplanan numuneyi 1/8 inç mikrouç kullanarak 15 saniyelik bir periyot kullanarak bir saniye açık ve iki saniye kapalı darbeleri yüzde 30 genlikte sonicate.
Daha sonra, önce 1,5 mililitrelik bir tüpte proteini reaksiyon tamponuyla karıştırarak 800 mikrolitrelik bir reaksiyon örneği hazırlayın. Sonra heparin ve thioflavin-T ekleyin ve yukarı ve aşağı beş kez pipetting tarafından iyice karıştırın. Hava kabarcıklarını ortadan kaldırmak için numuneleri 12, 000 x g ve 25 santigrat derecede beş dakika döndürün.
Santrifüjden sonra, hava kabarcıklarının oluşumunu önleyerek, 96 kuyulu bir mikroplakaiçinde kuyu başına 198 mikrolitre reaksiyon numunesi verin. Önceden oluşturulmuş fibral numuneyi üç kez yukarı ve aşağı borulandırarak homojenize edin. Her kuyuya istenilen tohum yüzdesine karşılık gelen miktarı ekleyin ve üç kez yukarı ve aşağı boruile karıştırın.
Sonra buharlaşmayı önlemek için mikroplaka mühür. Mikro plakayı çok modlu mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve ölçüme başlayın. Deney tamamlandıktan sonra, mikro plakayı ekipmandan çıkarın.
Ardından verileri elektronik tabloya aktarın. C291A ve C322A mutasyonları ve n terminali onun ve c terminal c-etiketleri içeren Rekombinant Tau, SDS sayfasında görselleştirilen son derece saf ve SEC-MALS tarafından değerlendirildiği gibi neredeyse yüzde 100 monomeriktir. Heparin indüklenen rekombinant Tau agregasyonu, 440 nanometre uyarma dalga boyu ve 485 nanometre emisyon dalga boyu kullanılarak tioflavin-T floresansı izledi.
Taht, 10 ayrı kuyunun neredeyse ayırt edilemez olmasıyla son derece tekrarlanabilir. Rekombinant Tau agregaları, bildirilen ex-vivo morfolojilerine benzer, farklı uzunluklarda fibüler yapıların homojen bir karışımıdır. Son reaksiyon karışımı monomer içermez, sec-MALS ölçümlerinde gösterildiği gibi agregalara tam bir dönüşüm önermektedir.
Bağımsız deneysel çalıştırmalarda rekombinant Tau agregasyonunun kinetikbenzer sigmoidal eğrileri ve ayırt edilemez gecikme ve büyüme aşamaları tarafından vurgulanan benzerdir. Farklı protein toplu işlerinin kullanılmasıyla yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik korunur. Önceden oluşturulmuş rekombinant Tau agregaları Tau monomer işe verimli ve de novo Tau agregaların oluşumunu indükleyen, ve sürecin verimliliği tohum yüzdesi ile doğru orantılıdır.
Hacim olarak ifade edilen önceden oluşmuş Tau agregalarının yüzde 0,0025'i kadar düşük miktarlar rekombinant Tau nükleasyonunu atlayabilme ve de novo fibral oluşumunu tetikleme yeteneğine sahiptir. Mevcut tsay, Tau'nun in vivo katlama ve toplama sıyrıkolduğuna inanılan şeyi taklit eder ve patogenez sürecine ışık tutabilecek ve uyuşturucu taraması ve sürecin farklı aşamalarına sahip ilaç adaylarının müdahalesini incelemek için değerli bir araç oluşturabilecek mekanistik çalışmalara olanak sağlar. Tazlığın yüksek tekrarlanabilirliği, bilim insanlarının bunu laboratuvarda göreceli olarak kolaylıkla uygulamasına olanak sağlayacaktır.
Mevcut töz sadece en uzun Tau izoform, insan Tau-441 odaklanır rağmen, uygulama farklı Tau varyantları çalışma adapte edilebilir. Ve unutmayın, doğru protein reaktifleri seçerek ve yüksek kalite standartlarında bunları üreten sağlam ve son derece tekrarlanabilir bir titreşme kurma esastır.
