La falta de desplazamiento de la proteína Tau en su autoensamble en filamentos helicoidales emparejados es un sello patológico de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías. Aquí presentamos un sólido ensayo de agregación Tau que podría ayudar a dilucidar el proceso de patogénesis Tau. La conversión sigue todos los pasos de un proceso de polimerización dependiente de la nucleación y es altamente reproducible, permitiendo la detección de fármacos en un formato más riguroso que cumplió con el nivel de OBSI hasta la fecha.
La calidad de los reactivos es crucial. El Tau recombinante necesita ser muy puro y carente de agregados y de fragmentos. En primer lugar, encienda el ordenador y el lector de microplacas multimodo.
Después de permitir que el equipo se estabilice, inicie el software y seleccione Protocolo estándar como tipo de protocolo. Establezca la temperatura en 37 grados centígrados y seleccione Precalentamiento antes de continuar con el protocolo. A continuación, establezca el tiempo de ejecución cinético en 50 horas y el intervalo de medición en 15 minutos.
Ajuste el temblor orbital a 425 ciclos por minuto en modo continuo. Después de esto, seleccione el método de lectura como momocromos cinéticos de punto final de fluorescencia. Establezca la longitud de onda de excitación en 440 nanómetros y la longitud de onda de emisión en 485 nanómetros, la posición óptica en la parte superior y la ganancia en 80.
Seleccione la velocidad de lectura normal y establezca la altura de lectura en 4,50 milímetros. A continuación, valide y guarde el protocolo. Inicie la ejecución con el protocolo creado.
Asigne un nombre al experimento, seleccione el destino del archivo recién creado y permita que el instrumento se equilibre previamente a la temperatura deseada. Para un experimento de conversión Tau recombinante espontáneo, prepare una muestra de reacción de 1.000 microlitros con 800 microlitros para fluorescencia de tioflavina-T y 130 microlitros para el análisis SEC-MALS mezclando primero la proteína con el tampón de reacción en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue la heparina y la tioflavina-T y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces.
Es importante ejecutar el protocolo con precisión para garantizar una alta reproducibilidad, mezclar reactivos en el mismo orden y mantenerse dentro de los plazos. Gire la muestra a 12.000 x g y 25 grados Celsius durante cinco minutos para eliminar las burbujas de aire. Después de la dosificación de centrifugación 200 microlitros de muestra de reacción por pozo en una microplaca de 96 pocódimos, evitando la formación de burbujas de aire.
A continuación, selle la microplaca para evitar la evaporación. Coloque la microplaca en un lector de microplacas multimodo. Seleccione la placa completa, o si la placa no está llena, seleccione los pozos que desea leer e inicie la medición.
Exporte los datos al software de procesamiento de datos. A continuación, retire la microplaca del equipo. A continuación, retire el sellador de la microplaca.
Mezclar la muestra agregada en los pozos pipeteando arriba y abajo dos veces, y agrupar las diferentes réplicas en tubos de 1,5 mililitros. Mezcle cada muestra a fondo pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces, y prescinda de 10 a 20 microlitros en una superficie de mica para analizar los agregados mediante microscopía de fuerza atómica. Después de esto, cosecha los agregados girando cada uno un tubo de 1,5 mililitros a 20.000 x g y 4 grados Centígrados durante una hora.
Analice el sobrenadante de SEC-MALS para confirmar la ausencia de Tau monomérico en la muestra, lo que indica una conversión correcta en agregados. A continuación, retire todo el sobrenadante restante y etiquete el tubo de 1,5 mililitros que contiene los agregados restantes con la concentración inicial de proteína Tau recombinante y el volumen de la muestra. Congela los agregados y guárdalos a 80 grados Centígrados.
Para un experimento de semillas, retire los agregados Tau recombinantes del congelador, agregue el volumen de búfer de reacción indicado en la etiqueta y permita que el tubo se estabilice a temperatura ambiente. A continuación, resuspender los agregados pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a ocho veces. Sonicar la muestra agregada de 200 microlitros sobre hielo usando un microtip de 1/8 pulgadas durante un período total de 15 segundos con pulsos de un segundo encendido y dos segundos apagados a una amplitud del 30 por ciento.
A continuación, prepare una muestra de reacción de 800 microlitros mezclando primero la proteína con el tampón de reacción en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, agregue la heparina y la tioflavina-T y mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces. Gire las muestras a 12.000 x g y 25 grados Celsius durante cinco minutos para eliminar las burbujas de aire.
Después de la centrifugación, dispensar 198 microlitros de muestra de reacción por pozo en una microplaca de 96 pocóculas, evitando la formación de burbujas de aire. Homogeneizar la muestra de fibral preformada pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces. Añadir la cantidad correspondiente al porcentaje deseado de semillas a cada pozo y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces.
A continuación, selle la microplaca para evitar la evaporación. Coloque la microplaca en el lector de microplacas multimodo e inicie la medición. Una vez completado el experimento, retire la microplaca del equipo.
A continuación, exporte los datos a una hoja de cálculo. Tau recombinante que contiene las mutaciones C291A y C322A y n terminal sus etiquetas c terminales y c son altamente puras como se visualizan en la página SDS y prácticamente 100 por ciento monoméricas según lo evaluado por SEC-MALS. La agregación Tau recombinante inducida por heparina fue seguida por fluorescencia tioflavina-T utilizando una longitud de onda de excitación de 440 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 485 nanómetros.
El ensayo es altamente reproducible con resultados de 10 pozos individuales siendo prácticamente indistinguibles. Los agregados Tau recombinantes son una mezcla homogénea de estructuras fibulares de diferentes longitudes, similar a las morfologías ex-vivo reportadas. La mezcla de reacción final no contiene monómero, lo que sugiere una conversión completa en agregados, como se muestra en las mediciones sec-MALS.
La cinética de la agregación Tau recombinante en corridas experimentales independientes es similar, como se enfatiza en curvas sigmoideales similares y fases de retraso y crecimiento indistinguibles. El alto nivel de reproducibilidad se mantiene cuando se utilizan diferentes lotes de proteínas. Los agregados Tau recombinantes preformados son eficientes en la contratación de monómeros Tau e inducir la formación de agregados de novo Tau, y la eficiencia del proceso es directamente proporcional al porcentaje de semillas.
Cantidades tan bajas como 0.0025 por ciento de los agregados Tau preformados expresados en volumen son capaces de eludir la nucleación Tau recombinante y desencadenar la generación de novo fibral. El ensayo actual imita lo que se cree que es el desdofolding in vivo y la agregación de Tau y permite estudios mecánicos que podrían arrojar luz sobre el proceso de patogénesis y constituye una valiosa herramienta para el cribado de fármacos y el estudio de la interferencia de los candidatos a fármacos con diferentes etapas del proceso. La alta reproducibilidad del ensayo permitirá a los científicos implementarlo con relativa facilidad en el laboratorio.
Aunque el ensayo actual se centra sólo en la isoforma Tau más larga, Tau-441 humana, la aplicación se puede adaptar para estudiar diferentes variantes de Tau. Y no lo olvides, la selección de los reactivos proteicos adecuados y su producción con altos estándares de calidad son esenciales para establecer un ensayo robusto y altamente reproducible.
