Il misfolding della proteina Tau nel suo auto-assemblaggio in filamenti elicoidici accoppiati è un segno patologico del morbo di Alzheimer e di altre Tauopatie. Qui presentiamo un robusto saggio di aggregazione Tau che potrebbe aiutare a chiarire il processo di patogenesi tau. La conversione segue tutte le fasi di un processo di polimerizzazione dipendente dalla nucleazione ed è altamente riproducibile, consentendo lo screening dei farmaci in un formato più rigoroso che ha soddisfatto il livello OBSI fino ad oggi.
La qualità dei reagenti è fondamentale. Il ricombinante Tau deve essere altamente puro e privo di aggregati e di frammenti. Prima accendere il computer e il lettore di micropiatte multimodale.
Dopo aver permesso all'apparecchiatura di stabilizzarsi, avviare il software e selezionare Protocollo standard come tipo di protocollo. Impostare la temperatura su 37 gradi Celsius e selezionare Preriscaldamento prima di continuare il protocollo. Impostare quindi il tempo di esecuzione cinetico su 50 ore e l'intervallo di misurazione su 15 minuti.
Impostare lo scuotimento orbitale su 425 cicli al minuto in modalità continua. In seguito, selezionare il metodo di lettura come momocromatori cinetici dell'intensità di fluorescenza. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione su 440 nanometri e la lunghezza d'onda di emissione a 485 nanometri, la posizione ottica verso l'alto e il guadagno a 80.
Selezionare la velocità di lettura normale e impostare l'altezza di lettura su 4,50 millimetri. Quindi convalidare e salvare il protocollo. Avviare l'esecuzione utilizzando il protocollo creato.
Denominare l'esperimento, selezionare la destinazione del file appena creato e consentire allo strumento di pre-equilibrare alla temperatura desiderata. Per un esperimento spontaneo di conversione tau ricombinante, preparare un campione di reazione di 1.000 microlitri con 800 microlitri per la fluorescenza tioflavina-T e 130 microlitri per l'analisi SEC-MALS mescolando prima la proteina con il tampone di reazione in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere eparina e tioflavina-T e mescolare bene pipettando su e giù cinque volte.
È importante eseguire il protocollo con precisione per garantire un'elevata riproducibilità, mescolare i reagenti nello stesso ordine e mantenerli entro i tempi previsti. Ruotare il campione a 12.000 x g e 25 gradi Celsius per cinque minuti per eliminare le bolle d'aria. Dopo la centrifugazione erogare 200 microlitri di campione di reazione per pozzo in una micropiatta da 96 po', evitando la formazione di bolle d'aria.
Quindi sigillare la micropiatta per evitare l'evaporazione. Posizionare la micropiatta in un lettore di micropiatte multimodale. Selezionare la piastra completa o, se la piastra non è piena, selezionare i pozzi da leggere e avviare la misurazione.
Esportare i dati nel software di elaborazione dati. Quindi rimuovere la micropiatta dall'apparecchiatura. Quindi, rimuovere il sigillare dalla micropiatta.
Mescolare il campione aggregato nei pozzetti pipettando su e giù due volte e mettere in comune le diverse repliche in tubi da 1,5 millilitri. Mescolare accuratamente ogni campione tubazione su e giù cinque volte e distribuire da 10 a 20 microlitri su una superficie di mica per analizzare gli aggregati mediante microscopia a forza atomica. In seguito, raccogliere gli aggregati ruotando ciascuno un tubo da 1,5 millilitri a 20.000 x g e 4 gradi Celsius per un'ora.
Analizzare il supernatante da SEC-MALS per confermare l'assenza di Tau monomerico nel campione, indicando una conversione riuscita in aggregati. Successivamente, rimuovere tutti i supernatanti rimanenti ed etichettare il tubo da 1,5 millilitri contenente gli aggregati rimanenti con la concentrazione iniziale della proteina Tau ricombinante e il volume del campione. Snap blocca gli aggregati e archivia a 80 gradi Celsius.
Per un esperimento seminato, rimuovere gli aggregati Tau ricombinanti dal congelatore, aggiungere il volume del buffer di reazione indicato sull'etichetta e lasciare che il tubo si stabilizzi a temperatura ambiente. Quindi rimospendare gli aggregati con pipettando su e giù da cinque a otto volte. Sonicare il campione aggregato da 200 microliter sul ghiaccio utilizzando una microtip da 1/8 di pollice per un periodo totale di 15 secondi con impulsi di un secondo e due secondi di disaggregazione al 30% di ampiezza.
Successivamente, preparare un campione di reazione di 800 microlitri mescolando prima la proteina con il tampone di reazione in un tubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere eparina e tioflavina-T e mescolare bene pipettando su e giù cinque volte. Ruotare i campioni a 12.000 x g e 25 gradi Celsius per cinque minuti per eliminare le bolle d'aria.
Dopo la centrifugazione, erogare 198 microlitri di campione di reazione per pozzo in una micropiatta da 96 porri, evitando la formazione di bolle d'aria. Omogeneizzare il campione fibrale pre-formato con pipettando su e giù tre volte. Aggiungere la quantità corrispondente alla percentuale desiderata di semi ad ogni pozzo e mescolare pipettando su e giù tre volte.
Quindi sigillare la micropiatta per evitare l'evaporazione. Posizionare la micropiatta nel lettore di micropiatte multimodale e avviare la misurazione. Al termine dell'esperimento, rimuovere la micropiatta dall'apparecchiatura.
Quindi esportare i dati in un foglio di calcolo. I Tau ricombinanti contenenti le mutazioni C291A e C322A e n terminali i suoi e c c-tag terminali sono altamente puri come visualizzato sulla pagina SDS e praticamente monomerici al 100% come valutato da SEC-MALS. L'aggregazione tau ricombinante indotta dall'eparina è stata seguita dalla fluorescenza tioflavina-T usando una lunghezza d'onda di eccitazione di 440 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 485 nanometri.
Il saggio è altamente riproducibile con risultati di 10 singoli pozzi praticamente indistinguibili. Gli aggregati tau ricombinanti sono una miscela omogenea di strutture fibulari di diverse lunghezze, simile alle morfologie ex-vivo riportate. La miscela di reazione finale non contiene monomero, suggerendo una conversione completa in aggregati, come mostrato dalle misurazioni SEC-MALS.
La cinetica dell'aggregazione tau ricombinante in serie sperimentali indipendenti è simile, come sottolineato da curve sigmoidali simili e fasi di ritardo e crescita indistinguibili. L'alto livello di riproducibilità viene mantenuto quando vengono utilizzati diversi lotti di proteine. Gli aggregati tau ricombinanti pre-formati sono efficienti nel reclutare monomero Tau e nell'indurre la formazione di aggregati de novo Tau, e l'efficienza del processo è direttamente proporzionale con la percentuale di semi.
Quantità fino a 0,0025% degli aggregati Tau pre-formati espressi in volume sono in grado di bypassare la nucleazione Tau ricombinante e innescare la generazione di fibrali de novo. L'attuale saggio imita quello che si ritiene essere l'in vivo misfolding e aggregazione di Tau e consente studi meccanicistici che potrebbero far luce sul processo di patogenesi e costituisce uno strumento prezioso per lo screening dei farmaci e lo studio dell'interferenza dei candidati ai farmaci con diverse fasi del processo. L'elevata riproducibilità del saggio consentirà agli scienziati di implementarlo con relativa facilità in laboratorio.
Sebbene il saggio attuale si concentri solo sull'isoforma Tau più lunga, il Tau-441 umano, l'applicazione può essere adattata per studiare diverse varianti tau. E non dimenticate che la selezione dei giusti reagenti proteici e la loro produzione ad elevati standard qualitativi sono essenziali per creare un saggio robusto e altamente riproducibile.
