Die Fehlfaltung von Tau-Protein in seiner Selbstmontage in gepaarte Spiralfilamente ist ein pathologisches Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit und anderer Tauopathien. Hier präsentieren wir einen robusten Tau-Aggregationstest, der helfen könnte, den Tau-Pathogenese-Prozess aufzuklären. Die Umwandlung folgt allen Schritten eines nukleationsabhängigen Polymerisationsprozesses und ist sehr reproduzierbar, was ein Arzneimittelscreening in einem strengeren Format ermöglicht, das das BISHERe OBSI-Niveau erreicht hat.
Die Qualität der Reagenzien ist entscheidend. Der rekombinante Tau muss hochrein und frei von Aggregaten und Fragmenten sein. Schalten Sie zuerst den Computer und den Multimode-Mikroplattenleser ein.
Nachdem Sie die Stabilisierung des Geräts zugelassen haben, starten Sie die Software und wählen Sie Standardprotokoll als Protokolltyp aus. Stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein, und wählen Sie Vorwärmung aus, bevor Sie das Protokoll fortsetzen. Legen Sie als Nächstes die kinetische Laufzeit auf 50 Stunden und das Messintervall auf 15 Minuten fest.
Stellen Sie das Orbitalschütteln im kontinuierlichen Modus auf 425 Zyklen pro Minute ein. Wählen Sie anschließend die Lesemethode als Fluoreszenzintensitätsendpunkt-Kinetinatoratoren aus. Stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 440 Nanometer und die Emissionswellenlänge auf 485 Nanometer, die Optikposition nach oben und die Verstärkung auf 80 ein.
Wählen Sie die normale Lesegeschwindigkeit aus und legen Sie die Lesehöhe auf 4,50 Millimeter fest. Überprüfen Sie dann das Protokoll, und speichern Sie es. Starten Sie die Ausführung mit dem erstellten Protokoll.
Benennen Sie das Experiment, wählen Sie das Ziel der neu erstellten Datei aus, und lassen Sie das Instrument auf die gewünschte Temperatur vorausstellen. Für ein spontanes rekombinantes Tau-Umwandlungsexperiment eine 1.000 Mikroliter-Reaktionsprobe mit 800 Mikrolitern für Thioflavin-T-Fluoreszenz und 130 Mikroliter für die SEC-MALS-Analyse vorbereiten, indem Sie zunächst das Protein mit dem Reaktionspuffer in einem 1,5 Milliliter-Rohr mischen. Dann Heparin und Thioflavin-T hinzufügen und gut mischen, indem Sie fünfmal auf und ab pfeifen.
Es ist wichtig, das Protokoll genau auszuführen, um eine hohe Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, Reagenzien in der gleichen Reihenfolge zu mischen und sich innerhalb von Zeitrahmen zu halten. Drehen Sie die Probe bei 12.000 x g und 25 Grad Celsius für fünf Minuten, um Luftblasen zu beseitigen. Nach zentrifugieren 200 Mikroliter Reaktionsprobe pro Bohrung in einer 96-Well-Mikroplatte, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden.
Versiegeln Sie dann die Mikroplatte, um Verdunstung zu vermeiden. Legen Sie die Mikroplatte in einen Multimode-Mikroplattenleser. Wählen Sie die vollständige Platte aus, oder wenn die Platte nicht voll ist, wählen Sie die zu lesenden Brunnen aus, und starten Sie die Messung.
Exportieren Sie die Daten in die Datenverarbeitungssoftware. Entfernen Sie dann die Mikroplatte aus dem Gerät. Entfernen Sie anschließend die Versiegelung von der Mikroplatte.
Mischen Sie die aggregierte Probe in den Brunnen, indem Sie zwei Mal nach oben und unten pfeifen, und bündeln Sie die verschiedenen Replikationen in 1,5 Milliliter-Röhren. Mischen Sie jede Probe gründlich, indem Sie fünfmal nach oben und unten pfeifen, und geben Sie 10 bis 20 Mikroliter auf einer Glimmeroberfläche aus, um die Aggregate durch Atomkraftmikroskopie zu analysieren. Anschließend ernten Sie die Aggregate, indem Sie jeweils 1,5 Milliliter Rohr bei 20, 000 x g und 4 Grad Celsius für eine Stunde drehen.
Analysieren Sie den Überstand von SEC-MALS, um das Fehlen monomerer Tau in der Probe zu bestätigen, was auf eine erfolgreiche Umwandlung in Aggregate hindeutet. Entfernen Sie anschließend alle verbleibenden Überstande und beschriften Sie die 1,5 Milliliter-Röhre, die die restlichen Aggregate enthält, mit der anfänglichen rekombinanten Tau-Proteinkonzentration und dem Probenvolumen. Fangen Sie die Aggregate einfrieren und bei 80 Grad Celsius lagern.
Für ein Gesätsexperiment die rekombinanten Tau-Aggregate aus dem Gefrierschrank entfernen, das auf dem Etikett angegebene Volumen des Reaktionspuffers hinzufügen und die Röhre auf Raumtemperatur stabilisieren lassen. Dann setzen Sie die Aggregate wieder aus, indem Sie fünf- bis achtmal nach oben und unten pfeifen. Sonicate die 200 Mikroliter aggregierte Probe auf Eis mit einer 1/8 Zoll Mikrospitze für einen Gesamtzeitraum von 15 Sekunden mit Impulsen von einer Sekunde auf und zwei Sekunden aus bei 30 Prozent Amplitude.
Als nächstes bereiten Sie eine 800 Mikroliter Reaktionsprobe vor, indem Sie zuerst das Protein mit dem Reaktionspuffer in einer 1,5 Milliliter-Röhre mischen. Dann Heparin und Thioflavin-T hinzufügen und gut mischen, indem Sie fünfmal auf und ab pfeifen. Drehen Sie die Proben bei 12.000 x g und 25 Grad Celsius für fünf Minuten, um Luftblasen zu beseitigen.
Nach zentrifugieren, geben Sie 198 Mikroliter Reaktionsprobe pro Brunnen in eine 96-Well-Mikroplatte, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Homogenisieren Sie die vorgeformte Fibralprobe, indem Sie dreimal nach oben und unten pfeifen. Fügen Sie die Menge, die dem gewünschten Prozentsatz der Samen entspricht, zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie, indem Sie dreimal nach oben und unten pfeifen.
Versiegeln Sie dann die Mikroplatte, um Verdunstung zu vermeiden. Legen Sie die Mikroplatte in den Multimode-Mikroplattenleser und starten Sie die Messung. Nachdem das Experiment abgeschlossen ist, entfernen Sie die Mikroplatte aus dem Gerät.
Exportieren Sie dann die Daten in eine Kalkulationstabelle. Rekombinanter Tau mit den C291A- und C322A-Mutationen und n Klemmen-C-Tags ist hochrein rein, wie auf der SDS-Seite visualisiert und nach Einschätzung von SEC-MALS zu nahezu 100 Prozent monomer. Auf die heparininduzierte rekombinante Tau-Aggregation folgte thioflavin-T-Fluoreszenz mit einer Anregungswellenlänge von 440 Nanometern und einer Emissionswellenlänge von 485 Nanometern.
Der Assay ist sehr reproduzierbar, wobei die Ergebnisse von 10 einzelnen Brunnen praktisch nicht zu unterscheiden sind. Die rekombinanten Tau-Aggregate sind eine homogene Mischung von fibulären Strukturen unterschiedlicher Länge, ähnlich wie gemeldete Ex-vivo-Morphologien. Das endige Reaktionsgemisch enthält kein Monomer, was auf eine vollständige Umwandlung in Aggregate hindeutet, wie die SEC-MALS-Messungen zeigen.
Die Kinetik der rekombinanten Tau-Aggregation in unabhängigen Versuchsläufen ist ähnlich, wie durch ähnliche Sigmoidalkurven und ununterscheidbare Verzögerungs- und Wachstumsphasen betont wird. Die hohe Reproduzierbarkeit wird beibehalten, wenn verschiedene Proteinchargen verwendet werden. Vorgeformte rekombinante Tau-Aggregate sind effizient bei der Rekrutierung von Tau-Monomer und der induzierenden Bildung von de novo Tau-Aggregaten, und die Effizienz des Prozesses ist direkt proportional zum Anteil der Samen.
Mengen von bis zu 0,0025 Prozent der im Volumen exprimierten vorgeformten Tau-Aggregate sind in der Lage, die rekombinante Tau-Kernbildung zu umgehen und die de novo fibrale Erzeugung auszulösen. Der aktuelle Test imitiert die vermutlich in vivo Fehlfaltung und Aggregation von Tau und ermöglicht mechanistische Studien, die Licht auf den Pathogenese-Prozess werfen könnten und ein wertvolles Werkzeug für das Drogenscreening und die Untersuchung der Interferenz von Wirkstoffkandidaten mit verschiedenen Stadien des Prozesses darstellen. Die hohe Reproduzierbarkeit des Tests wird es den Wissenschaftlern ermöglichen, ihn relativ einfach im Labor umzusetzen.
Obwohl sich der aktuelle Assay nur auf die längste Tau-Isoform, den menschlichen Tau-441, konzentriert, kann die Anwendung an die Untersuchung verschiedener Tau-Varianten angepasst werden. Und vergessen Sie nicht, dass die Auswahl der richtigen Proteinreagenzien und deren Herstellung unter hohen Qualitätsstandards für die Einrichtung eines robusten und hochreproduzierbaren Assays unerlässlich sind.
