O descompactamento da proteína Tau em sua auto-montagem em filamentos helicosos emparelhados é uma marca patológica da doença de Alzheimer e outras Tauopatias. Aqui apresentamos um robusto ensaio de agregação tau que poderia ajudar a elucidar o processo de patogênese tau. A conversão segue todas as etapas de um processo de polimerização dependente de nucleação e é altamente reprodutível, permitindo a triagem de medicamentos em um formato mais rigoroso que atendeu ao nível OBSI até o momento.
A qualidade dos reagentes é crucial. O Tau recombinante precisa ser altamente puro e desprovido de agregados e de fragmentos. Primeiro ligue o computador e o leitor de microplacões multimodo.
Depois de permitir que o equipamento se estabilize, inicie o software e selecione Protocolo Padrão como o tipo de protocolo. Defina a temperatura para 37 graus Celsius e selecione Pré-aqueça antes de continuar o protocolo. Em seguida, defina o tempo de execução cinético para 50 horas e o intervalo de medição para 15 minutos.
Ajuste o tremor orbital para 425 ciclos por minuto em modo contínuo. Após isso, selecione o método de leitura como momochromators cinéticos de intensidade de fluorescência. Defina o comprimento de onda de excitação para 440 nanômetros e o comprimento de onda de emissão para 485 nanômetros, a posição óptica para cima, e o ganho para 80.
Selecione a velocidade de leitura normal e defina a altura de leitura para 4,50 milímetros. Em seguida, validar e salvar o protocolo. Inicie a execução usando o protocolo criado.
Nomeie o experimento, selecione o destino do arquivo recém-criado e permita que o instrumento se equilibre previamente à temperatura desejada. Para um experimento de conversão tau recombinante espontâneo, prepare uma amostra de reação de 1.000 microliteres com 800 microliters para fluorescência thioflavina-T, e 130 microlitres para análise SEC-MALS, misturando pela primeira vez a proteína com o tampão de reação em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione heparina e thioflavina-t e misture bem por pipetting para cima e para baixo cinco vezes.
É importante executar o protocolo precisamente para garantir alta reprodutibilidade, misturar reagentes na mesma ordem e manter dentro de prazos. Gire a amostra a 12.000 x g e 25 graus Celsius por cinco minutos para eliminar bolhas de ar. Após a centrifugação dispensar 200 microliters de amostra de reação por poço em uma microplacão de 96 poços, evitando a formação de bolhas de ar.
Em seguida, sele a microplacão para evitar a evaporação. Coloque a microplacão em um leitor de microplato multimode. Selecione a placa completa ou se a placa não estiver cheia, selecione os poços a serem lidos e inicie a medição.
Exporte os dados para o software de processamento de dados. Em seguida, remova a microplacão do equipamento. Em seguida, remova o selador da microplacão.
Misture a amostra agregada nos poços por pipetação para cima e para baixo duas vezes, e acumule as diferentes réplicas em tubos de 1,5 mililitro. Misture cada amostra cuidadosamente por pipetar para cima e para baixo cinco vezes, e dispense 10 a 20 microliters em uma superfície mica para analisar os agregados por microscopia de força atômica. Na sequência, colde os agregados girando cada um tubo de 1,5 mililitro a 20.000 x g e 4 graus Celsius por uma hora.
Analise o supernatante pela SEC-MALS para confirmar a ausência de Tau monomédico na amostra, indicando uma conversão bem sucedida em agregados. Em seguida, remova todos os supernacantes restantes e rotule o tubo de 1,5 mililitro contendo os demais agregados com a concentração inicial de proteína Tau recombinante e o volume amostral. Espergue os agregados e armazene a 80 graus Celsius.
Para um experimento semeado, remova os agregados tau recombinantes do congelador, adicione o volume de tampão de reação indicado no rótulo e permita que o tubo estabilize até a temperatura ambiente. Em seguida, resuspense os agregados pipetting para cima e para baixo cinco a oito vezes. Sonicar a amostra agregada de 200 microliter no gelo usando uma microfina de 1/8 polegadas por um período total de 15 segundos com pulsos de um segundo ligado e dois segundos fora com 30% de amplitude.
Em seguida, prepare uma amostra de reação de 800 microliter misturando a proteína com o tampão de reação em um tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione heparina e thioflavina-t e misture bem por pipetting para cima e para baixo cinco vezes. Gire as amostras a 12.000 x g e 25 graus Celsius por cinco minutos para eliminar bolhas de ar.
Após a centrifugação, dispense 198 microliters de amostra de reação por poço em uma microplacão de 96 poços, evitando a formação de bolhas de ar. Homogeneize a amostra de fibral pré-formada por pipetação para cima e para baixo três vezes. Adicione a quantidade correspondente à porcentagem desejada de sementes em cada poço e misture por pipetar para cima e para baixo três vezes.
Em seguida, sele a microplacão para evitar a evaporação. Coloque a microplacão no leitor de microplacões multimodo e inicie a medição. Após a conclusão do experimento, remova a microplacão do equipamento.
Em seguida, exporte os dados para uma planilha. Tau recombinante contendo as mutações C291A e C322A e n terminal suas e c-tags terminais são altamente puras como visualizadas na página SDS e praticamente 100% monoméricas como avaliado pela SEC-MALS. A agregação tau recombinante induzida por heparina foi seguida pela fluorescência thioflavina-T usando um comprimento de onda de excitação de 440 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 485 nanômetros.
O ensaio é altamente reprodutível com resultados de 10 poços individuais sendo virtualmente indistinguíveis. Os agregados tau recombinantes são uma mistura homogênea de estruturas fibulares de diferentes comprimentos, semelhante às morfologias ex-vivo relatadas. A mistura de reação final não contém monômero, sugerindo uma conversão completa em agregados, como mostrado pelas medidas SEC-MALS.
A cinética da agregação tau recombinante em corridas experimentais independentes são semelhantes, como enfatizado por curvas sigmoidal semelhantes e fases de lag e crescimento indistinguíveis. O alto nível de reprodutibilidade é mantido quando diferentes lotes de proteína são usados. Os agregados tau recombinantes pré-formados são eficientes no recrutamento do monômero Tau e na formação indutora de agregados de novo Tau, e a eficiência do processo é diretamente proporcional com a porcentagem de sementes.
Valores tão baixos quanto 0,0025 por cento dos agregados tau pré-formados expressos em volume são capazes de contornar a nucleação Tau recombinante e desencadear a geração de novo fibral. O ensaio atual imita o que se acredita ser o descompacto in vivo e agregação de Tau e permite estudos mecanicistas que poderiam lançar luz sobre o processo de patogênese e constitui uma ferramenta valiosa para o rastreamento de medicamentos e estudo da interferência de candidatos a medicamentos com diferentes estágios do processo. A alta reprodutibilidade do ensaio permitirá que os cientistas o implementem com relativa facilidade em laboratório.
Embora o ensaio atual se concentre apenas no mais longo tau isoform, humano Tau-441, a aplicação pode ser adaptada para estudar diferentes variantes tau. E não se esqueça, selecionar os reagentes proteicos certos e produzi-los a altos padrões de qualidade são essenciais para criar um ensaio robusto e altamente reprodutível.
