此方法可以帮助回答关键问题，例如视网膜组织中的能量代谢在生物样本之间如何不同，或在接触药理剂后。该技术的主要优点是，它利用外植的有机视网膜组织来测量糖解和氧化磷酸化的速率，并允许评估体外实时干预。要校准细胞外通量测定的仪器，首先在24个井传感器盒的每个井中加入一毫升的校准溶液，并在37摄氏度的Co2无培养箱中孵育过夜。
将线粒体应力协议或糖解协议中的添加剂加载到传感器盒上的每个喷油器端口中，根据井中的体积变化进行调整。假设初始井容量为 450 微升，典型的测定将包括 45 微升的添加剂进入第一喷油器端口，49.5 微升进入第二个喷油器端口，54.5 微升进入第三个喷油器，60 微升进入最后。在前几次实验中，将基座介质加载到端口 A 中，以测量端口注射后发生的组织运动伪影量。
允许加载的传感器板在非 Co2 培养箱中以 37 摄氏度孵育至少 60 分钟。开始用新鲜安乐死小鼠隔离新鲜小鼠视网膜组织。使用一对中等大小的弯曲钳子抓住视神经的后球，轻轻施加向前压力来支撑眼睛。
使用干净的剃须刀刀片，使用刀片的单个故意通过，在角膜上创建边缘切口。使用细角麦克弗森风格的钳子，捏后球，以表达镜头和前催眠膜的角膜切口。用钳子重复捏合动作以表达神经视网膜。
然后，像勺子一样用钳子将视网膜从角膜切口上抬开。将视网膜直接放入三厘米的培养皿或六井组织培养簇盘中的暖介质中。接下来，使用两对细角麦克弗森的风格钳子轻轻地解剖视网膜上剩余的视网膜。
这是最好的工作，通过抓住视网膜杯外围的玻璃，并拉向中心，最终分离的玻璃体从整个中心。然后，从视网膜的光受体表面去除任何残留的视网膜色素上皮。用剃须刀切割 P1000 移液器尖端，以创建大约 4 毫米的开口，以防止在转移过程中对细腻的视网膜组织造成不必要的创伤。
然后，使用切割移液器尖端将分离的视网膜组织转移到新鲜介质中。最后，使用配备柱塞的一毫米活检孔，在视神经周围切割视网膜的冲孔。将视网膜冲孔放在干净的介质上，保存在 37 摄氏度的方块上，或加热垫上。
收集到所需的冲孔数后，使用可爱的 P1000 尖端在 450 微升介质中吸气单个冲孔，并将其转移到 37 摄氏度热垫或热块上的 24 孔眼皮捕获微板。使用精细、直钳轻轻操纵冲孔进入微板的中心。保持冲孔朝向同一方向。
例如，用结节细胞侧向上。对于每个实验，留出三到四个空白井，其中450个微升基介质作为负控制。在避免气泡或过度移动的同时，轻轻地将小孔捕获网格插入到每个孔中，并将刀片用金属柱塞或切割的 P1000 移液器尖端固定。
虽然微型腔室有足够的深度来容纳典型的小鼠视网膜，但偶尔网状插入中的机器缺陷会导致组织在屏幕插入过程中变得过度压缩。如果发生这种情况，只需记下这种粉碎的组织，然后从最终分析中排除该样本。在37摄氏度的二氧化碳无二培养箱中孵育组织板至少60分钟。
使用混合、重量、测量和重复命令对额外的蜂窝通量分析仪进行编程。例如，视网膜组织的典型实验可能包括以下内容。混合两分钟，等待两分钟，测量五分钟。
重复实验，这三个步骤在五到八次之间进行基准线记录，并在测试的每个化合物注射后重复。按细胞外通量分析仪上的程序启动按钮，然后按照屏幕上的说明插入传感器盒进行校准。在校准结束时，按照屏幕上的说明将校准板替换为包含视网膜样本的板，然后允许程序按照编程运行。
运行完成后，按照屏幕上的说明弹出组织板。查看运行结果并存储数据文件。用弯曲的 20 表针和钳子，从井中去除所有网状刀片，留下视网膜冲头。
小心地从组织中吸出培养基，用0.5毫升的冷磷酸盐缓冲盐水洗涤组织两次。吸气第二次PBS洗涤后，每次洗涤时加入100微升的解液缓冲液，并上下移液器进行均质化组织。最后，通过一对一稀释 1 个 lysed 样品，用 100 微升 Tris-EDTA 缓冲液，将稀释样品的 100 微升转移到 96 井板，根据总双绞合 DNA 含量对输入电平进行定量。
然后，向每个井添加 100 微升检测缓冲器，混合两到五分钟。最后，通过与标准曲线比较，在480纳米的激发和520纳米的发射后量化荧光。将原始的细胞外通量追溯到井内的DNA含量。
在基准线上，在5毫毫升葡萄糖存在的情况下，在10毫摩尔丙酮酸酯的存在下，以细胞外酸化率测量的酸脂率没有显著差异。在视网膜组织之间，来自枯萎型动物，或淘汰缺乏机制关闭循环核苷酸门离子通道以响应光刺激的小鼠。在添加20毫耳血糖和糖解抑制剂2DG后，也可以看到类似的模式。
这些数据可能在数学上转换，以表示基线的分数变化，这种格式可以可以更好地比较不同的实验干预。基线的绝对耗氧率在控制和突变视网膜组织之间也是等值的。增加20毫摩尔葡萄糖会增加线粒体呼吸，但在绝对定量或基线变化方面，各组之间观察到的呼吸没有变化。
添加一毫升穆勒FCCP，一种未脱钩剂，以证明最大的线粒体呼吸速率不会显著增加OCR高于高葡萄糖在控制和突变视网膜组织的水平。然而，在加入RAA鸡尾酒后，来自两只小鼠的信号急剧下降。最后，我们演示了一种在小鼠视网膜的有机体外阴中氧化磷酸化和糖解率的定量技术。
通过有效隔离视网膜组织，该技术可进行可靠且可重复的测量。可以评估暴露的实时影响，如脱钩剂。除了这个程序，其他方法，如定量RTPCR和西印迹，可以在解剖步骤中分离的余组织上执行，以获得与视网膜代谢研究相关的平行信息。
