この方法は、生物学的サンプル間や薬理薬への暴露後に、レチン組織のエネルギー代謝がどのように異なるかなどの重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、解糖症と酸化リン酸化の両方の速度を測定するために、外植された有機的なレチナル組織を利用し、インビトロでのリアルタイム介入の評価を可能にすることです。細胞外フラックスアッセイの計測器を校正するには、まず24ウェルセンサーカートリッジの各ウェルに1ミリリットルのキャリブレーション溶液を追加し、Co2フリーインキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートします。
ミトコンドリア応力プロトコルの添加剤、またはセンサーカートリッジの各インジェクターポートへの解糖プロトコルの負荷添加物は、ウェル内の体積変化に合わせて調整する。最初の井戸容積は450マイクロリットルと仮定すると、一般的なアッセイには、第1インジェクターポートへの添加剤45マイクロリットル、第2インに49.5マイクロリットル、3番目に54.5マイクロリットル、最後まで60マイクロリットルが含まれる。最初のいくつかの実験の間に、ポートAにベースメディアをロードして、ポート注入後に発生する組織移動アーティファクトの量を測定します。
負荷のセンサープレートを、非Co2インキュベーターで37°Cで少なくとも60分間インキュベートします。新鮮なマウスのレチン組織を安楽死させたマウスで分離し始める。中型の湾曲した鉗子を使用して視神経で後部地球儀をつかみ、眼を下支にするために前方圧力を穏やかに加えます。
きれいなカミソリの刃で、刃の単一の意図的なパスを使用して角膜を横切って手足を切開する手足を作成します。細かい角度のマクファーソンスタイルの鉗子を使用して、角膜切開部からレンズと前ヒロイド膜を表現するために後部地球儀をつまみます。鉗子でつまみ操作を繰り返して、神経の残りを表現します。
次に、スプーンのような鉗子を使用して、角膜切開から離れてレチナを持ち上げます。3センチメートル皿、または6つのウェル組織培養クラスタープレートで直接温かい媒体にレチナを置きます。次に、細かい角度のマクファーソンのスタイル鉗子を2組使用して、残りの炎を残りの部分を離散させる。
これは、レチナルカップの周辺での膜子をつかみ、中央に向かって引っ張り、全体として中央から膜炎体を最終的に取り除くことによって行われます。次に、網膜の光受容体表面から残存性網膜色素上皮を除去する。P1000ピペットチップをカミソリの刃で切り取り、転写中の繊細なレチナル組織への過度の外傷を防ぐために、およそ4ミリメートルの開口部を作成します。
次いで、切り取ったピペットチップを使用して、単離したレチン組織を新鮮な培地に移す。最後に、プランジャーを装備した1ミリメートルの生検パンチを使用して、視神経の周りのレティナのパンチをカットします。レティナルパンチを清潔な媒体に置き、37°Cブロック、または加熱パッドに保管します。
必要な数のパンチが収集されたら、かわいいP1000チップを使用して450マイクロリットルの媒体で個々のパンチを吸引し、37°Cヒートパッドまたはヒートブロック上の24ウェルアイレットキャプチャマイクロプレートに転送します。細かいストレート鉗子を使用して、マイクロプレートの中央にパンチを穏やかに操作します。パンチは同じ方向に向けて保管してください。
例えば、神経節細胞側を上向きにします。各実験のために否定的な制御として役立つベース媒体の450マイクロリットルと3〜4つの空の井戸を取っておいた。気泡や過度の動きを避けながら、アイレットキャプチャメッシュインサートを各ウェルにそっと配置し、金属プランジャーまたはカットP1000ピペットチップで挿入物を固定します。
マイクロチャンバは、典型的なマウスのretinaを収容するのに十分な深さを有するが、時折、メッシュ挿入物の機械欠陥は、画面挿入中に組織が過度に圧縮される原因となる。この場合は、この破砕された組織をメモし、そのサンプルを最終分析から除外します。37°Cの炭酸ガスフリーインキュベーターで組織プレートを少なくとも60分間インキュベートします。
ミックス、重量、測定、および繰り返しコマンドを使用して、余分なセルラーフラックスアナライザをプログラムします。一例として、代表的なレチン組織の実験には、以下のものが含まれ得る。2分間混ぜ、2分待って、5分を計ります。
この3つのステップを5~8回の間で行い、各化合物を注入した後に試験を行います。細胞外フラックスアナライザのプログラム開始ボタンを押し、画面の指示に従って、キャリブレーション用のセンサーカートリッジを挿入します。キャリブレーションの最後に、画面の指示に従って、校正用プレートを、レチナルサンプルを含むプレートに置き換え、プログラムをプログラムどおりに実行できるようにします。
実行が完了したら、画面の指示に従って組織プレートを取り出します。実行の結果を表示し、データ ファイルを格納します。曲がった20ゲージ針と鉗子で、すべてのメッシュインサートを井戸から取り除き、後ろにレチナルパンチを残します。
慎重に組織から培地を吸引し、0.5ミリリットルの冷リン酸緩衝生理食塩水で組織を2回洗浄する。2回目のPBS洗浄を吸引した後、各洗浄に100マイクロリットルの溶菌バッファーを加え、ピペットを上下に加えて組織を均質化します。最後に、Lys-EDTAバッファーの100マイクロリットルで溶出したサンプルを1対1に希釈し、希釈したサンプルの100マイクロリットルを96ウェルプレートに移すことによって、全二本鎖DNA含有量に基づいて入力レベルを定量化します。
その後、各ウェルに検出バッファーの100マイクロリットルを追加し、2〜5分間混合します。最後に、480ナノメートルで励起した後の蛍光を定量し、標準曲線と比較して520ナノメートルで発光する。ウェル内のDNA含有量に対する生の細胞外フラックストを正規化します。
塩基系において、5ミリのミュラーグルコースの存在下で、10ミリのミュラーピルビン酸の存在下で、細胞外酸性化速度によって測定される酸還流の速度に有意差がない。ワイル型動物由来のレチナル組織の間、または光刺激に応答して環状ヌクレオチドゲートイオンチャネルを閉じるための機械を欠いているマウスをノックアウトする。同様のパターンは、20ミリのミュラーグルコースおよび解糖抑制剤2DGを添加した後に見られる。
これらのデータは、ベースラインからの小数変化を表すために数学的に変換され得る、 異なる実験的介入間のより良い比較を可能にする形式である。ベースラインにおける絶対酸素消費速度も、対照と変異型のレチン組織との間でも同等である。20ミリのミュラーグルコースの添加は、ミトコンドリア呼吸を増加させるが、絶対的な定量化の観点またはベースラインからの変化の点でグループ間で観察された変化はない。
非結合剤である1ミリミュラーFCCPを添加することは、最大ミトコンドリア呼吸数を実証するために、コントロールおよび突然変異性の高グルコースとの高いレベルを上回るOCRを有意に増加させない。しかし、RAAカクテルを添加した後、両マウスからのシグナルは大幅に低下します。結論として、マウスの外植体における酸化リン酸化と解糖の割合を定量化する手法を示す。
レチン組織の効率的な分離により、この技術は信頼性が高く、再び可能な測定を生み出します。アンカップリング剤などの露光のリアルタイム効果を評価できます。この手順に加えて、定量的RTPCRおよびウェスタンブロッティングのような他の方法は、解剖工程で単離された余剰組織に対して行われ、レチン代謝の研究に関連する並行情報を得ることができる。
