Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés telles que la façon dont le métabolisme énergétique dans le tissu rétinien diffère entre les échantillons biologiques, ou après l’exposition à des agents pharmacologiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle utilise du tissu rétinien organotypique explanté pour mesurer les taux de glycolyse et de phosphorylation oxydée et permet d’évaluer les interventions en temps réel in vitro. Pour calibrer l’instrumentation d’un test de flux extracellulaire, ajoutez d’abord un millilitre de solution d’étalonnage à chaque puits de la cartouche de capteur de puits 24, et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur libre de Co2 pendant la nuit.
Chargez les additifs pour le protocole de stress mitochondrial, ou le protocole de glycolyse dans chaque port d’injecteur sur la cartouche du capteur, en ajustant pour les changements de volume dans le puits. En supposant un volume initial de puits de 450 microlitres, un essai typique comprendrait 45 microlitres d’un additif dans le premier port injecteur, 49,5 microlitres dans le second, 54,5 microlitres dans le troisième, et 60 microlitres dans le dernier. Au cours des premières expériences, chargez le milieu de base dans le port A pour évaluer la quantité d’artefacts de mouvement tissulaire qui se produit après une injection au port.
Laissez la plaque du capteur chargé couver à 37 degrés Celsius dans un incubateur non co2 pendant au moins 60 minutes. Commencez l’isolement du tissu rétinien frais de souris avec une souris fraîchement euthanasiée. Utilisez une paire de forceps incurvés de taille moyenne pour saisir le globe postérieur au nerf optique, et appliquez doucement la pression vers l’avant pour proptose l’oeil.
À l’aide d’une lame de rasoir propre, créer un limbus à l’incision des limbes à travers la cornée à l’aide d’un seul passage délibéré de la lame. À l’aide de forceps de style McPherson à angle fin, pincez le globe postérieur pour exprimer la lentille et les membranes hyloïdes antérieures de l’incision cornéenne. Répétez la manœuvre de pincement avec des forceps pour exprimer la rétine neurale.
Ensuite, utilisez les forceps comme une cuillère pour soulever la rétine loin de l’incision cornéenne. Placez la rétine directement dans le milieu chaud dans un plat de trois centimètres, ou une plaque de cluster de culture des tissus de six puits. Ensuite, utilisez deux paires de forceps de style McPherson à angle fin pour disséquer doucement le reste vitré de la rétine.
Il est préférable de le faire en saisissant le vitré à la périphérie de la tasse rétinienne, et en tirant vers le centre, avec une désinsertion finale du corps vitreux du centre dans son ensemble. Ensuite, retirez tout épithélium rétinien résiduel de pigment de la surface du récepteur photo de la rétine. Coupez une pointe de pipette P1000 à l’aide d’une lame de rasoir pour créer une ouverture d’environ quatre millimètres afin d’éviter un traumatisme indu au tissu rétinien délicat pendant les manœuvres de transfert.
Ensuite, utilisez la pointe de pipette coupée pour transférer le tissu rétinien isolé dans un milieu frais. Enfin, utilisez un poinçon d’une biopsie d’un millimètre équipé d’un piston, pour couper les poinçons de la rétine autour du nerf optique. Mettre les poinçons rétiniens de côté dans un milieu propre, maintenu sur un bloc de 37 degrés Celsius, ou coussin chauffant.
Une fois que le nombre désiré de poinçons ont été recueillis, utilisez la pointe mignonne de P1000 pour aspirer un poinçon individuel dans 450 microlitres de milieu, et transférez-le à une microplaque de capture de 24 puits d’oeillet sur un coussin chauffant ou un bloc thermique de 37 degrés Celsius. Utilisez des forceps fins et droits pour manipuler délicatement les poinçons au centre de la micro plaque. Gardez les coups de poing orientés dans la même direction.
Par exemple, avec le côté ganglionnaire vers le haut. Pour chaque expérience mis de côté trois à quatre puits vierges avec 450 microlitres de milieu de base pour servir de contrôles négatifs. Tout en évitant les bulles d’air ou les mouvements excessifs, placez doucement les inserts de maille de capture d’oeillet dans chaque puits, et fixez les inserts avec un piston en métal ou avec une pointe de pipette P1000 coupée.
Bien que la microch chambre ait une profondeur suffisante pour accueillir la rétine typique de la souris, parfois les défauts de la machine dans les inserts en maille font que les tissus deviennent trop comprimés pendant l’insertion de l’écran. Si cela se produit, il suffit de prendre note de ce tissu broyé, et d’exclure cet échantillon de l’analyse finale. Incuber la plaque tissulaire dans un incubateur sans dioxyde de carbone de 37 degrés Celsius pendant au moins 60 minutes.
Programmez l’analyseur de flux cellulaire supplémentaire à l’aide de commandes de mélange, de poids, de mesure et de répétition. À titre d’exemple, une expérience typique avec le tissu rétinien peut inclure ce qui suit. Mélanger deux minutes, attendre deux minutes et mesurer cinq minutes.
Répétez l’expérience avec ces trois étapes entre cinq et huit fois pour l’enregistrement de la ligne de base, et après injection de chaque composé testé. Appuyez sur le bouton de démarrage du programme sur l’analyseur de flux extracellulaire, et suivez les instructions sur l’écran pour insérer la cartouche du capteur pour l’étalonnage. À la fin de l’étalonnage, suivez les instructions sur l’écran pour remplacer la plaque calibrée par la plaque contenant les échantillons rétiniens, puis laissez le programme fonctionner comme programmé.
À la fin de la course, suivez les instructions sur l’écran pour éjecter la plaque de tissu. Consultez les résultats de l’exécuter et stockez le fichier de données. À l’aide d’une aiguille et d’un forceps pliés de calibre 20, retirez tous les inserts en maille des puits, laissant derrière eux le poinçon rétinien.
Aspirez soigneusement le milieu du tissu, et lavez le tissu deux fois avec 0,5 millilitres de salin tamponné au phosphate froid. Après avoir aspiré le deuxième lavage PBS, ajouter 100 microlitres de tampon de lyse à chaque lavage, et pipette de haut en bas pour homogénéiser les tissus. Enfin, quantifier les niveaux d’entrée en fonction de la teneur totale en ADN double brin en diluant les échantillons lysés un à un, avec 100 microlitres de tampon Tris-EDTA, et en transférant 100 microlitres de l’échantillon dilué à une plaque de puits de 96.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres de tampon de détection à chaque puits et mélangez pendant deux à cinq minutes. Enfin, quantifier la florescence après excitation à 480 nanomètres et les émissions à 520 nanomètres en comparant à une courbe standard. Normaliser le flux extracellulaire brut traçant la teneur en ADN dans le puits.
À la ligne de base, en présence du glucose de cinq milli muller et en présence du pyruvate de muller de 10 milli, il n’y a aucune différence significative dans les taux d’eflux acide, mesurés par le taux extracellulaire d’acidification. Entre les tissus rétiniens des animaux de type flétrissement, ou assommer les souris qui n’ont pas la machinerie pour fermer les canaux ioniques fermés au nucléotide cyclique en réponse à des stimuli lumineux. Des modèles semblables sont vus après addition du glucose de Muller de 20 milli et de l’inhibiteur glycolytique 2DG.
Ces données peuvent être mathématiquement transformées pour représenter des changements fractionnels par rapport à la ligne de base, un format qui peut permettre une meilleure comparaison entre les différentes interventions expérimentales. Le taux absolu de consommation d’oxygène à la ligne de base est également équivalent entre le contrôle et le tissu rétinien mutant. L’ajout de glucose muller de 20 milli augmente la respiration mitochondriale, mais aucun changement n’a été observé entre les groupes en termes de quantification absolue ou en termes de changement par rapport à la ligne de base.
L’ajout d’un milli muller FCCP, un agent de découplage, pour démontrer les taux respiratoires mitochondraux maximaux n’augmente pas significativement ocr au-dessus du niveau vu avec le glucose élevé dans le contrôle et le tissu rétinien mutant. Cependant, les signaux des deux souris chutent considérablement après l’ajout du cocktail RAA. En conclusion, nous démontrons une technique pour quantifier des taux de phosphorylation oxydée et de glycolyse dans les explants organotypiques de la rétine de souris.
Avec l’isolement efficace du tissu rétinien, la technique donne des mesures fiables et reproudcables. Les effets en temps réel des expositions, comme le découplage des agents, peuvent être évalués. En plus de cette procédure, d’autres méthodes, comme le RTPCR quantitatif et le ballonnement occidental, peuvent être exécutées sur le tissu excédentaire isolé dans l’étape de dissection pour obtenir l’information parallèle pertinente aux études du métabolisme rétinien.
