Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten, wie energiestoffwechsel im Netzhautgewebe unterscheidet sich zwischen biologischen Proben, oder nach der Exposition gegenüber pharmakologischen Mitteln. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie explantiertes organotypisches Netzhautgewebe nutzt, um die Raten sowohl der Glykolyse als auch der oxidierten Phosphorylierung zu messen und die Beurteilung von Echtzeitinterventionen in vitro ermöglicht. Um die Instrumentierung für einen extrazellulären Flusstest zu kalibrieren, fügen Sie zunächst einen Milliliter Kalibrierlösung zu jedem Brunnen der 24 Well-Sensorpatrone hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem Co2-freien Inkubator über Nacht.
Belasten Sie Additive für das mitochondriale Spannungsprotokoll oder das Glykolyseprotokoll in jeden Injektoranschluss der Sensorpatrone, um Volumenänderungen im Brunnen einzustellen. Bei einem anfänglichen Brunnenvolumen von 450 Mikrolitern würde ein typischer Test 45 Mikroliter eines Additivs in den ersten Injektoranschluss, 49,5 Mikroliter in den zweiten, 54,5 Mikroliter in den dritten und 60 Mikroliter in den letzten enthalten. Während der ersten Experimente, Laden Basismedium in Port A, um zu messen, wie viel Gewebebewegung Artefakt nach einer Port-Injektion auftritt.
Lassen Sie die geladene Sensorplatte mindestens 60 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Nicht-Co2-Inkubator brüten. Beginnen Sie die Isolierung von frischem Maus-Retinagewebe mit einer frisch eingeschläferten Maus. Verwenden Sie ein Paar mittelgroße gekrümmte Zangen, um den hinteren Globus am Sehnerv zu erfassen, und ziehen Sie sanft Vorwärtsdruck an, um das Auge zu stützen.
Mit einer sauberen Rasierklinge, erstellen Sie einen Limbus zu Limbus Schnitt über die Hornhaut mit einem einzigen, absichtlichen Pass der Klinge. Mit fein abgewinkelten McPherson-Zangen, kneifen Sie die hintere Kugel, um die Linse und vordere Hyloidmembranen aus dem Hornhautschnitt auszudrücken. Wiederholen Sie das Kneifmanöver mit Zangen, um die neuronale Netzhaut auszudrücken.
Dann verwenden Sie die Zange wie ein Löffel, um die Netzhaut weg von der Hornhauteinschnitt zu heben. Legen Sie die Netzhaut direkt in das warme Medium in einer drei Zentimeter großen Schale oder einer sechs Brunnengewebe-Kultur-Clusterplatte. Als nächstes verwenden Sie zwei Paare von fein abgewinkelten McPhersons Style Zangen, um die verbleibenden Glaskörper sanft von der Netzhaut zu sezieren.
Dies geschieht am besten, indem man den Glaskörper an der Peripherie des Netzhautbechers erfasst und in Richtung Zentrum zieht, mit einer endgültigen Disinsertion des Glaskörpers aus dem Zentrum als Ganzes. Entfernen Sie dann alle verbleibenden retinalen Pigmentepithel von der Photorezeptoroberfläche der Netzhaut. Schneiden Sie eine P1000 Pipettenspitze mit einer Rasierklinge, um eine ungefähre Öffnung von vier Millimetern zu schaffen, um ein ungebührliches Trauma des empfindlichen Netzhautgewebes bei Transfermanövern zu verhindern.
Dann verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um das isolierte Netzhautgewebe in ein frisches Medium zu übertragen. Schließlich verwenden Sie einen ein Millimeter Biopsie-Punch mit einem Kolben ausgestattet, um Schläge der Netzhaut um den Sehnerv zu schneiden. Stellen Sie die Netzhautschläge in sauberem Medium beiseite, halten Sie auf einem 37 Grad Celsius Block oder Heizkissen.
Sobald die gewünschte Anzahl von Schlägen gesammelt wurde, verwenden Sie die süße P1000-Spitze, um einen individuellen Stempel in 450 Mikrolitern Medium zu aspirieren, und übertragen Sie ihn auf eine 24 well ösen Capture Mikroplatte auf einem 37 Grad Celsius Heizpad oder Wärmeblock. Verwenden Sie feine, gerade Zangen, um Schläge in die Mitte der Mikroplatte sanft zu manipulieren. Halten Sie Schläge in die gleiche Richtung orientiert.
Zum Beispiel mit der Ganglienzellseite nach oben. Für jedes Experiment beiseite drei bis vier leere Brunnen mit 450 Mikroliter Basismedium als Negativkontrollen dienen. Unter Vermeidung von Luftblasen oder übermäßiger Bewegung, positionieren Sie die Ösen sanft Die Mesh-Einsätze in jedem Brunnen, und sichern Sie die Einsätze mit einem Metallkolben oder mit einer geschnittenen P1000 Pipettenspitze.
Obwohl die Mikrokammer über eine ausreichende Tiefe verfügt, um die typische Mausnetzhaut aufzunehmen, führen gelegentlich Maschinendefekte in den Netzeinsätzen dazu, dass Gewebe während des Einsetzens des Bildschirms übermäßig komprimiert werden. Wenn dies geschieht, notieren Sie sich einfach dieses zerkleinerte Gewebe und schließen Sie diese Probe von der endgültigen Analyse aus. Inkubieren Sie die Gewebeplatte in einem 37 Grad Celsius kohlendioxidfreien Inkubator für mindestens 60 Minuten.
Programmieren Sie den zusätzlichen Zellflussanalysator mit Mix-, Gewichts-, Mess- und Wiederholungsbefehlen. Ein typisches Experiment mit Netzhautgewebe kann beispielsweise Folgendes umfassen. Zwei Minuten mischen, zwei Minuten warten und fünf Minuten messen.
Wiederholen Sie das Experiment mit diesen drei Schritten zwischen fünf und acht Mal für die Basislinienaufzeichnung und nach der Injektion jeder getesteten Verbindung. Drücken Sie die Starttaste des Programms am extrazellulären Flussanalysator, und befolgen Sie die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Sensorpatrone zur Kalibrierung einzulegen. Befolgen Sie am Ende der Kalibrierung die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Kalibrierplatte durch die Platte zu ersetzen, die die Netzhautproben enthält, und lassen Sie dann das Programm wie programmiert laufen.
Befolgen Sie nach Abschluss des Laufs die Anweisungen auf dem Bildschirm, um die Gewebeplatte auszuwerfen. Zeigen Sie die Ergebnisse der Ausführung an, und speichern Sie die Datendatei. Mit einer gebogenen 20-Meter-Nadel und Zange, entfernen Sie alle Netzeinsätze aus den Brunnen, so dass die Netzhaut Punsch hinter.
Saugen Sie das Medium vorsichtig aus dem Gewebe und waschen Sie das Gewebe zweimal mit 0,5 Milliliter kaltephosphat gepufferte Saline. Nach dem Angieren der zweiten PBS-Wäsche 100 Mikroliter Lysepuffer zu jeder Wäsche und Pipette nach oben und unten hinzufügen, um Gewebe zu homogenisieren. Schließlich quantitieren Sie die Eingangswerte auf der Grundlage des gesamten Doppelsträngigen-DNA-Gehalts, indem Lysed-Proben eins zu eins mit 100 MikroliterTris-EDTA-Puffer verdünnt und 100 Mikroliter der verdünnten Probe auf eine 96-Well-Platte übertragen werden.
Fügen Sie dann 100 Mikroliter Detektionspuffer zu jedem Brunnen hinzu und mischen Sie sie zwei bis fünf Minuten lang. Schließlich quantitieren Sie die Blütenstand nach Anregung bei 480 Nanometern und die Emission bei 520 Nanometern im Vergleich zu einer Standardkurve. Normalisieren Sie die rohe extrazelluläre Flussverfolgung zu DNA-Inhalten innerhalb des Brunnens.
An der Basislinie, in Gegenwart von fünf Milli-Muller-Glukose und in Gegenwart von 10 Milli-Muller-Pyruvat, gibt es keinen signifikanten Unterschied in den Raten des sauren Efluxes, gemessen an der extrazellulären Versauerungsrate. Zwischen Netzhautgeweben von Wildtieren oder Ausstoßmäusen, denen die Maschinerie fehlt, um zyklische Nukleotid-Gated-Ionen-Kanäle als Reaktion auf leichte Reize zu schließen. Ähnliche Muster sind nach Zugabe von 20 Milli Muller Glukose und dem glykolytischen Inhibitor 2DG zu sehen.
Diese Daten können mathematisch transformiert werden, um bruchstückhafte Veränderungen ab dem Ausgangswert darzustellen, ein Format, das einen besseren Vergleich zwischen verschiedenen experimentellen Interventionen ermöglichen kann. Die absolute Sauerstoffverbrauchsrate zu Beginn ist auch gleichwertig zwischen Kontrolle und mutiertem Netzhautgewebe. Die Zugabe von 20 Milli Muller Glukose erhöht die mitochondriale Atmung, aber keine Veränderung der beobachteten zwischen den Gruppen in Bezug auf absolute Quantifizierung oder in Bezug auf die Veränderung von DerAusgangsbasis.
Die Zugabe von einem Milli-Muller FCCP, einem Entkopplungsmittel, um maximale mitochondriale Atemfrequenzen zu demonstrieren, erhöht OCR nicht signifikant über dem Niveau, das mit hoher Glukose in der Kontrolle und mutiertem Netzhautgewebe beobachtet wurde. Allerdings sinken die Signale beider Mäuse nach dem Zusatz des RAA-Cocktails drastisch. Abschließend zeigen wir eine Technik zur Quantifizierung der Raten der oxidierten Phosphorylierung und Glykolyse in organotypischen Explanten der Mausnetzhaut.
Durch die effiziente Isolierung des Netzhautgewebes liefert die Technik zuverlässige und reproudierbare Messungen. Echtzeiteffekte von Expositionen, wie z. B. Entkopplungsmittel, können bewertet werden. Zusätzlich zu diesem Verfahren können andere Methoden, wie quantitative RTPCR und Western Blotting, auf dem überschüssigen Gewebe durchgeführt werden, das im Sezierschritt isoliert wurde, um parallele Informationen zu erhalten, die für Studien des Netzhautstoffwechsels relevant sind.
