이 방법은 망막 조직에 있는 에너지 물질 대사가 생물학 견본 사이 또는 약리학 에이전트에 노출 후에 어떻게 다른지와 같은 중요한 질문에 대답하는 것을 도울 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 글리코리시스와 산화 된 인산화의 비율을 측정하기 위해 이식 된 organotypic 망막 조직을 활용하고 체외에서 실시간 개입의 평가를 허용한다는 것입니다. 세포외 플럭스 분석에 대한 계측을 보정하려면 먼저 24개의 웰 센서 카트리지의 각 웰에 1밀리리터의 교정 솔루션을 추가하고 하룻밤 동안 Co2 무료 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 배양합니다.

미토콘드리아 응력 프로토콜또는 글리코리시스 프로토콜을 센서 카트리지의 각 인젝터 포트에 적재하여 우물의 부피 변화를 조정합니다. 450 마이크로리터의 초기 음부피를 가정하면, 일반적인 분석에는 제1 인젝터 포트에 첨가제 45 마이크로리터, 두 번째 삽입기 포트에 49.5 마이크로리터, 세 번째마이크로리터54.5 마이크로리터, 마지막까지 60 마이크로리터가 포함됩니다. 처음 몇 가지 실험 동안, 포트 A에 기본 배지를 로드하여 포트 주입 후 발생하는 조직 이동 아티팩트의 양을 측정합니다.

로드된 센서 플레이트가 비 Co2 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 최소 60분 동안 배양할 수 있도록 허용합니다. 갓 안락사 된 마우스로 신선한 마우스 망막 조직의 격리를 시작합니다. 중간 크기의 곡면 포셉을 사용하여 시신경에서 후방 전세계를 파악하고 전방 압력을 부드럽게 적용하여 눈을 전파합니다.

깨끗한 면도날로 블레이드의 의도적인 단일 패스를 사용하여 각막을 가로지르는 림푸스 절개를 만듭니다. 미세 각진 McPherson 스타일 포셉을 사용하여 후면 글로브를 꼬집어 각막 절개에서 렌즈와 전방 hyloid 멤브레인을 표현합니다. 신경 망막을 표현하기 위해 집게로 꼬집기 기동을 반복합니다.

그런 다음 숟가락처럼 집게를 사용하여 각막 절개에서 망막을 들어 올립니다. 망막을 3센티미터 접시 또는 6개의 잘 조직 배양 클러스터 플레이트에 직접 넣습니다. 다음으로, 두 쌍의 미세각 맥퍼슨 스타일 포셉을 사용하여 망막에서 남은 유리체를 부드럽게 해부합니다.

이것은 망막 컵의 주변에서 유리체를 잡고 중앙으로 당겨중앙을 향해 당겨서 중앙에서 유리체의 최종 분리와 함께 하는 것이 가장 좋습니다. 그런 다음, 망막의 사진 수용체 표면에서 잔류 잔류 안료 상피를 제거한다. P1000 파이펫 팁을 면도날로 잘라 서 약 4밀리미터 개구부를 만들어 이송 기동 중 섬세한 망막 조직에 대한 과도한 외상을 방지합니다.

그런 다음 절단 파이펫 팁을 사용하여 격리된 망막 조직을 신선한 배지로 옮길 수 있습니다. 마지막으로 플런저를 장착한 1mm 생검 펀치를 사용하여 시신경 주위의 망막 펀치를 잘라냅니다. 망막 펀치를 깨끗한 매체에 따로 놓고 섭씨 37도 블록 또는 가열 패드에 보관하십시오.

원하는 수의 펀치가 수집되면 귀여운 P1000 팁을 사용하여 중간 크기의 450 마이크로 리터에 개별 펀치를 흡입하고 37도 의 섭씨 열 패드 또는 히트 블록에 24 웰 아일렛 캡처 마이크로 플레이트로 전송하십시오. 미세하고 직선적인 집게를 사용하여 마이크로 플레이트의 중앙으로 펀치를 부드럽게 조작합니다. 펀치를 같은 방향으로 유지합니다.

예를 들어, 신경절 세포 측을 위쪽으로 합니다. 각 실험에 대해 450 마이크로리터의 베이스 배지가 있는 3~4개의 빈 우물을 따로 따로 두어 음의 대조군역할을 한다. 기포 나 과도한 움직임을 피하면서, 아일렛 캡처 메쉬 인서트를 각 우물에 부드럽게 배치하고 금속 플런저 또는 절단 P1000 파이펫 팁으로 인서트를 고정합니다.

마이크로 챔버는 일반적인 마우스 망막을 수용하기에 충분한 깊이를 가지고 있지만, 때때로 메쉬 인서트의 기계 결함은 화면 삽입 중에 조직이 지나치게 압축되는 원인이됩니다. 이 경우, 단순히이 분쇄 된 조직의 메모를하고 최종 분석에서 그 샘플을 제외합니다. 티슈 플레이트를 37도 의 이산화탄소 무료 인큐베이터에서 적어도 60분 동안 배양합니다.

혼합, 무게, 측정 및 반복 명령을 사용하여 여분의 셀룰러 플럭스 분석기를 프로그래밍합니다. 예를 들어, 망막 조직을 가진 전형적인 실험은 다음을 포함할 수 있다. 2분간 섞고 2분간 기다린 후 5분간 기다립니다.

기저선 레코딩을 위해 5~8회 사이의 이 세 가지 단계로 실험을 반복하고, 각 화합물의 주입 후 시험한다. 외세포 플럭스 분석기의 프로그램 시작 버튼을 누르고 화면의 지침을 따라 보정을 위해 센서 카트리지를 삽입합니다. 교정의 끝에서 교정을 통해 교정판을 망막 샘플이 포함된 플레이트로 교체한 다음 프로그램이 프로그래밍된 대로 실행할 수 있도록 합니다.

실행이 완료되면 화면의 지침을 따라 티슈 플레이트를 배출합니다. 실행 결과를 보고 데이터 파일을 저장합니다. 구부러진 20 게이지 바늘과 집게로 우물에서 모든 메쉬 인서트를 제거하고 망막 펀치를 뒤로 합니다.

조심스럽게 조직에서 배지를 흡인하고, 차가운 인산염 완충식염의 0.5 밀리리터로 조직을 두 번 씻는다. 두 번째 PBS 세척을 심은 후, 각 세척에 100 마이크로리터의 용해 완충제를 추가하고 조직을 균질화하기 위해 피펫을 위아래로 넣습니다. 마지막으로, 트리스-EDTA 버퍼100마이크로리터를 1-1로 희석하고 희석된 시료의 100마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 전송하여 총 이중 좌초 된 DNA 함량을 기반으로 입력 수준을 양으로 전달합니다.

그런 다음 각 웰에 100 마이크로리터의 검출 버퍼를 추가하고 2~5분 동안 혼합합니다. 마지막으로, 표준 곡선과 비교하여 480 나노미터에서 발광 및 520 나노미터에서 배출한 후 수량으로 플로레시엔션을 수량화한다. 우물 내의 DNA 함량에 원시 세포 외 플럭스 추적을 정규화합니다.

기본 라인에서, 5 밀리 뮬러 포도당의 존재와 존재 10 밀리 뮬러 피루바테, 산성 유출의 비율에 유의한 차이가 없다, 세포 외 산성화 속도에 의해 측정. wile 형 동물에서 망막 조직 사이, 또는 빛 자극에 대 한 응답으로 순환 뉴클레오티드 게이트 이온 채널을 닫기 위해 기계가 부족 마우스를 노크. 유사한 패턴은 20 밀리 뮬러 포도당과 글리코리스틱 억제제 2DG를 첨가한 후에 보입니다.

이러한 데이터는 다른 실험 적 개입 간의 더 나은 비교를 허용할 수 있는 형식인 기준선에서 분수 변화를 나타내기 위해 수학적으로 변형될 수 있습니다. 기준선에서 절대 산소 소비 속도는 또한 제어 및 돌연변이 망막 조직 사이 동일합니다. 20 밀리 뮬러 포도당의 첨가는 미토콘드리아 호흡을 증가, 하지만 절대 정량화의 측면에서 또는 기준선에서 변화의 관점에서 그룹 사이에 관찰에 변화가 없습니다.

1 밀리 뮬러 FCCP의 추가, 분리 에이전트, 최대 미토콘드리아 호흡 속도를 입증하기 위해 크게 제어 및 돌연변이 망막 조직에서 높은 포도당으로 본 수준 이상의 OCR을 증가하지 않습니다. 그러나 RAA 칵테일을 첨가한 후 두 마우스의 신호가 크게 떨어집니다. 결론적으로, 우리는 마우스 망막의 organotypic 파종의 산화 인산화 및 글리코립시스의 양을 양화하기위한 기술을 보여줍니다.

망막 조직의 효율적인 격리로 이 기술은 신뢰할 수 있고 자랑스러운 측정을 생성합니다. 분리 제와 같은 노출의 실시간 효과를 평가할 수 있습니다. 이 절차 이외에, 정량적 RTPCR 및 서부 블로팅과 같은 다른 방법은 방부 단계에서 분리된 잉여 조직에서 수행되어 망막 대사의 연구와 관련된 병렬 정보를 얻을 수 있다.