旋转盘TIRF显微镜是研究蛋白质在细胞骨骼网络形成过程中作用的有用工具。该技术允许对细胞中发生的快速细胞方法进行三维成像，同时可以精确定位位于等离子膜中的荧光分子。这种方法可以提供对微生物学、细胞生物学等研究领域的见解，以及研究血浆膜与细胞环境之间相互作用的重要分支。
此方法可以扩展到那些活成像实验，其中重要的是本地化等离子膜的结构，在那里你还需要保持剩余细胞体积的高分辨率。必须考虑的关键事项是选择适当的细胞系来设置TIRF照明和其他成像参数，并找到转染细胞的焦点。该协议的可视化演示肯定有助于避免在图像采集过程中处理单元格的问题。
实验前两天，种子3000个HLA或NIH 3T3细胞在两毫升的全生长培养中进入六井细胞培养板的每个井中。第二天，准备转染试剂。首先，稀释一微克的RFP利夫克特和一微克的YFP文库林，共200微升的减少血清介质。
短暂地涡旋转染试剂。然后将混合物的四微升加入200微升的DNA。再次对试剂进行涡旋，然后在室温下孵育转染混合物15至20分钟。
孵育后，将整个转染混合物直接滴到细胞中。通过摇动盘子混合水井，然后放回培养箱。在实验当天，首先在PBS中涂上35毫米玻璃底盘，每毫升纤维素溶液10微克，为现场成像准备样品。
将溶液留在玻璃表面，在室温下30分钟，然后将其取出，让盘子干燥。接下来，将直径为 0.1 微米的多荧光珠溶液稀释至蒸馏水中每毫升 18 亿粒的密度。将溶液添加到纤维素涂层玻璃表面 30 至 60 秒。
然后取出溶液，让盘子风干。使用荧光珠预涂盘仅出于两个原因，首先，如果要在播种细胞之前找到 TIRF 平面，或者获取双色珠图像以进行图像注册。现在，在生长介质中加入0.1摩尔抗坏血酸溶液，以0.1毫摩尔的最终浓度来准备抗氧化生长介质。
将媒体放在 37 摄氏度的水浴中，预热媒体。接下来，用两毫升PBS清洗细胞，并在盘子的每个井中加入250微升的三辛EDTA。在37摄氏度下孵育细胞，等待两到三分钟，直到细胞完全分离。
将细胞小心地重新在一毫升的预受氧化生长培养培养中，并在15毫升细胞培养管中加入另外4毫升的培养。将细胞悬浮液放在37摄氏度的培养箱中，用5%的二氧化碳缓冲。首先，开始对显微镜进行环境控制，以实现稳定的细胞培养条件。
然后将含有一毫升预警告的抗氧化生长介质的玻璃底盘放入预热显微镜的样品架中。接下来，在成像软件中，在显微镜下设置采集设置。将采集时间间隔设置为 30 秒，持续时间设置为 60 到 90 分钟之间。
此外，通过将值设置为 1，激活基于硬件的自动对焦功能。现在，将摄像机曝光度调整为 200 毫秒，增益级别调整为 500，激光功率调整为 20%。建议高增益水平、低曝光时间和低激光功率，以降低光毒性。
接下来，将旋转磁盘通道的 Z 堆栈设置为 10 微米，间距为 0.4 微米，然后将底部偏移设置为零，以便最低平面将成为硬件自动对焦的焦点位置，并停用 TIRF 通道的 Z 堆栈。最后，激活多点函数阶段位置。这样，在 30 秒的间隔内最多记录三个位置。
现在找到荧光珠，荧光照明，激活一个TIRF通道，将照明角度设置为表示TIRF照明的值。接下来，通过按下显微镜面板上的按钮激活自动对焦，然后使用偏移轮调整对焦。一旦对焦，使用 TIRF 488 和 TIRF 561 获取双色数据集，以便随后进行基于珠子的图像注册。
从培养箱中取出细胞，通过反转闭合管两到三次混合细胞悬浮液。然后将一毫升的细胞涂抹到成像盘中。快速找到具有低电位荧光照明的双转染细胞。
找到后，使用亮场照明将实时摄像机预览中的单元格居中并标记位置。然后找到另外一到两个兴趣点，将它们保存到位置列表，然后通过单击序列按钮开始数据采集。在开始，细胞可以很容易地分离由于阶段运动，所以最好是设置四到五个位置，然后丢弃一个或两个。
为了在斐济生成无注册超堆栈，请先下载并保存提供的文件 SD-TIRF_helper_jove。ijm 在斐济子文件夹宏中。通过单击菜单命令来运行宏，从插件开始，然后从宏开始，最后运行。
如果颜色通道需要注册更正，请选择该选项并创建新的基于珠子的注册参考，称为地标文件。接下来，导入数据与生物格式导入，并选择超堆栈作为查看选项。加载映像数据集，在第一步中选择旋转磁盘系列，在第二步中选择 TIRF 系列。
此时，斐济将显示按通道和阶段位置排序的数据。通过加载预定的地标文件，将注册更正应用于相应的通道。然后为每个旋转磁盘和 TIRF 通道选择所需的颜色查找表，并将其合并到单个多维超堆栈中。
在处理 TIRF 映像期间，将一些 zed 平面添加到底部平面，此数字与旋转磁盘数据集中的平面数匹配。这对于最终超堆栈的可视化表示非常重要。使用本视频中描述的设置，在 60 分钟的延时时间内选择了 YFP 和 RFP 表达细胞，并观察了它们的粘附过程。
正如所料，细胞是圆形的，在开始时只有微弱的粘附体，膜突起会感应环境并接触基板。细胞基质接触在形成所谓的新生粘附物后迅速加强。随着时间的推移，粘附复合物扩大和成熟到焦点粘附。
这些拉长的结构在细胞的外围主要明显。这源于由Actomyosin纤维施加的力，这些力导致细胞基质粘附的加强以及作用素纤维的捆绑。细胞也因行为网络的形成而变平。
采集速度取决于以下参数、时间间隔、曝光时间、zed 平面数和位置数。因此，针对高采集率优化这些参数非常重要。最新旋转磁盘技术的实现，将使旋转磁盘TIRF显微镜成为新的超分辨率显微镜技术，使成像在高时空速率下。
旋转盘显微镜是一种非常强大的技术，用于研究细胞内部和细胞膜之间的过程。我们已经证明，我们可以跟踪囊泡的动态，通过获得非常大的图像堆栈在几秒钟内。胶合激光对眼睛有害。
切勿直视光束，并使用仪器的安全预防措施，以避免直接暴露在光下。
