يمكن أن يكون التصوير المجهري للقرص TIRF الغزلي أداة مفيدة لدراسة دور البروتين أثناء تكوين شبكة الهيكل العظمي. سمحت هذه التقنية التصوير ثلاثي الأبعاد من النهج الخلوية السريعة التي تحدث في الخلية وفي نفس التعريب الدقيق لجزيء الفلوريسنس التي يتم وضعها في غشاء البلازما. هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لمجالات البحث مثل علم الأحياء الدقيقة، وبيولوجيا الخلايا، وجميع تلك الفروع حيث أنه من المهم لدراسة التفاعل بين غشاء البلازما والبيئة الخلوية.
يمكن أن تمتد هذه الطريقة إلى تلك التجارب التصوير الحي حيث أنه من المهم توطين الهياكل في غشاء البلازما وحيث تريد أيضا للحفاظ على درجة عالية من الصوت الخلوي المتبقية. الأشياء الحاسمة التي يجب على المرء أن يأخذها في الاعتبار هي اختيار خط الخلية المناسب لإعداد إضاءة TIRF ومعلمات التصوير الأخرى والعثور على تركيز الخلايا المصابة. ومن شأن العرض التوضيحي المرئي لهذا البروتوكول أن يساعد بالتأكيد على تجنب المشاكل المتعلقة بالتعامل مع الخلايا أثناء الحصول على الصور.
قبل يومين من التجربة، بذور 3،000 هيلا أو NIH 3T3 الخلايا في مليلتر اثنين من متوسط النمو الكامل في كل بئر من لوحة ثقافة الخلية ستة بئر. في اليوم التالي، قم بإعداد الكواشف المُعدّة. أولاً، تمييع ميكروغرام واحد من RFP ليفكت وم ميكروغرام واحد من YFP Vinculin في ما مجموعه 200 ميكرولترات من متوسطة المصل المخفضة.
دوامة كاشف transfection لفترة وجيزة. ثم إضافة أربعة ميكرولترات من الخليط إلى 200 ميكرولترات من الحمض النووي. دوامة الكواشف مرة أخرى ومن ثم احتضان مزيج transfection لمدة 15 إلى 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الحضانة، إضافة مزيج كامل transfection قطرة الحكمة مباشرة إلى الخلايا. اخلط الآبار عن طريق هز الصحن ثم وضعه مرة أخرى في الحاضنة. في يوم التجربة، إعداد العينة للتصوير الحي عن طريق طلاء أول طبق أسفل الزجاج 35 ملليمتر مع 10 ميكروغرام لكل ملليلتر حل من Fibronectin في برنامج تلفزيوني.
اترك المحلل على سطح الزجاج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بإزالته واترك هواء الطبق جافًا. بعد ذلك، تمييع محلول حبة متعددة الفلورسنت قطرها 0.1 ميكرون إلى كثافة 1.8 مليار جزيء لكل ملليلتر في الماء المقطر. أضف الحل إلى سطح الزجاج المغلف بالليفية لمدة 30 إلى 60 ثانية.
ثم إزالة الحل والسماح للهواء الجافة طبق. precoating من الأطباق مع الخرز الفلورسنت ضروري فقط لسببين، أولا إذا كنت ترغب في العثور على الطائرة TIRF قبل بذر الخلايا أو للحصول على صورة حبة ملونة اثنين لتسجيل الصور. الآن إعداد مضادة للأكسدة متوسطة النمو بإضافة 0.1 حمض الأسكوربيك الضرس في تركيز النهائي من 0.1 ميليمولار في متوسط النمو.
قبل أن تُطرّئ وسائل الإعلام بوضعها في حمام مائي 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، قم بغسل الخلايا بمليلترين من PBS وإضافة 250 ميكرولتر من تريبسين EDTA إلى كل بئر من اللوحة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية وانتظر من دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتم فصل الخلايا تماما.
Resuspend الخلايا بعناية في ملليلتر واحد من قبل مضادة للأكسدة متوسطة النمو وإضافتها إلى أربعة ملليلتر إضافية من المتوسطة في 15 ملليلتر خلية ثقافة أنبوب. ضع تعليق الخلية مع غطاء مفتوح قليلاً في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون. للبدء، بدء التحكم البيئي للمجهر لتحقيق ظروف ثقافة الخلية مستقرة.
ثم ضع طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على ملليلتر واحد من متوسط النمو المضاد للأكسدة قبل الإحترام في حامل العينة من المجهر المُحمّى مسبقًا. بعد ذلك، في برنامج التصوير، قم بإعداد إعدادات الاستحواذ عند المجهر. تعيين فترة وقت الامتلاك إلى 30 ثانية والمدة إلى ما بين 60 و 90 دقيقة.
أيضا، تنشيط وظيفة التركيز البؤري التلقائي من التركيز التلقائي المستندة إلى الأجهزة لكل نقطة الوقت عن طريق تعيين القيمة إلى واحد. الآن ضبط التعرض للكاميرا إلى 200 مللي ثانية ، ومستوى كسب إلى 500 ، وقوة الليزر إلى 20 ٪ لكل قناة. ويوصى بمستويات كسب عالية، وانخفاض وقت التعرض، وانخفاض قوة الليزر للحد من السمية الضوئية.
بعد ذلك، قم بتعيين مكدس Z للقنوات القرص الغزل إلى 10 ميكرون مع 0.4 ميكرون التباعد، ثم تعيين إزاحة أسفل إلى صفر بحيث يكون أدنى مستوى يكون موضع التركيز من التركيز البؤري للأجهزة وتعطيل مكدسات Z للقنوات TIRF. وأخيرا، قم بتنشيط وظائف مرحلة الوظائف متعددة النقاط. وهذا يسمح لتسجيل ثلاثة مواقع على مدى فترة 30 ثانية.
الآن العثور على الخرز الفلورسنت مع الإضاءة epifluorescent، وتفعيل قناة TIRF واحد وتعيين زاوية الإضاءة إلى القيمة التي تدل على الإضاءة TIRF. بعد ذلك، قم بتنشيط التركيز البؤري التلقائي عن طريق الضغط على الزر في لوحة المجهر وضبط التركيز مع عجلة الإزاحة. بمجرد التركيز، الحصول على مجموعة بيانات ملونة باستخدام TIRF 488 و TIRF 561 لتسجيل الصور اللاحقة القائمة على الخرز.
إزالة الخلايا من الحاضنة وخلط تعليق الخلية عن طريق عكس أنبوب مغلق مرتين إلى ثلاث مرات. ثم ضعي مليلتر واحد من الخلايا على طبق التصوير. العثور بسرعة على الخلايا المصابة المزدوجة مع انخفاض مستوى الإضاءة epifluorescent.
بمجرد العثور عليها، توسّع الخلايا في معاينة الكاميرا المباشرة باستخدام الإضاءة في المجال الساطع ووضع علامة على الموضع. ثم العثور على نقطة إضافية من واحد إلى نقطتين من الفائدة، حفظها إلى قائمة المواقف والبدء في الحصول على البيانات من خلال النقر على زر التسلسل. في البداية، يمكن للخلايا أن تنفصل بسهولة بسبب حركة المرحلة لذلك من الأفضل تعيين أربعة إلى خمسة مواقع وفيما بعد على التخلص من واحد أو اثنين.
من أجل توليد هايبركاك خالية من التسجيل في فيجي، أولاً تحميل وحفظ الملف المقدم SD-TIRF_helper_jove. ijm في وحدات الماكرو في فيجي المجلد الفرعي. تشغيل الماكرو عن طريق النقر على الأمر القائمة بدءا من الإضافات ثم وحدات الماكرو وأخيرا تشغيل.
إذا كانت قنوات الألوان تحتاج إلى تصحيح التسجيل، حدد الخيار وأنشئ مرجع تسجيل جديد قائم على حبة يعرف باسم ملف معلم. بعد ذلك ، قم باستيراد البيانات مع مستورد التنسيقات الحيوية واختر هايبركاكس كخيار عرض. تحميل مجموعة بيانات الصورة، حدد سلسلة القرص الغزل في الخطوة الأولى وسلسلة TIRF في الخطوة الثانية.
وعند هذه النقطة، ستعرض فيجي البيانات التي تم فرزها حسب القناة وموقع المرحلة. تطبيق تصحيح التسجيل على القنوات المعنية عن طريق تحميل ملف المعلم المحدد مسبقاً. ثم حدد جدول البحث عن اللون المطلوب لكل قرص الغزل وقناة TIRF ودمجها في كومة واحدة فرط متعددة الأبعاد.
خلال معالجة الصور TIRF، يتم إضافة عدد من الطائرات zed إلى أسفل الطائرة وهذا العدد يتطابق مع عدد الطائرات في مجموعات بيانات القرص الغزل. هذا مهم جداً للتمثيل المرئي للـ"هايبركاك" النهائي. باستخدام الإعداد الموضح في هذا الفيديو، تم اختيار الخلايا YFP وRFP المعبرة عن ذلك، ولوحظت عملية التصاقها خلال فترة زمنية مدتها 60 دقيقة.
كما هو متوقع، كانت الخلايا على شكل دائري وناسجة ضعيفة فقط في البداية مع نتوءات الغشاء الاستشعار عن البيئة وإجراء اتصال مع الركيزة. خلية مصفوفة اتصال عززت بسرعة عند تشكيل ما يسمى الالتصاقات الوليدة. على مدار الوقت، مجمعات الالتصاق الموسعة ونضجت إلى الالتصاقات المحورية.
وكانت هذه الهياكل الممدودة ظاهرة في الغالب على أطراف الخلية. نتج هذا من القوى التي بذلت من قبل ألياف actomyosin التي أدت إلى تعزيز الالتصاقات مصفوفة الخلية وكذلك تجميع ألياف actin. كما تم تسطيح الخلية نتيجة لتشكيل شبكة الاتصال actin.
تعتمد سرعة الاكتساب على المعلمات التالية، والفترة الزمنية، ووقت التعرض، وعدد الطائرات zed وعدد المواضع. لذلك من المهم جداً تحسين هذه المعلمات لارتفاع معدلات الاستحواذ. تنفيذ أحدث تكنولوجيا القرص الغزل تحويل القرص الغزل TIRF المجهرية إلى تقنية جديدة فائقة القرار المجهرية التي من شأنها أن تسمح التصوير بمعدلات زمنية عالية.
المجهر القرص الغزل هو تقنية قوية جدا لدراسة العمليات التي تحدث بين داخل الخلية وغشاء الخلية. لقد تبين لنا أننا يمكن أن تتبع دينامية من حائل من خلال الحصول على أكوام صورة كبيرة جدا في غضون ثوان قليلة. ضوء الليزر التكولي هو خطر على العينين.
لا تنظر مباشرة في الحزمة واستخدام احتياطات السلامة من الصك لتجنب التعرض للضوء المباشر.
