A microscopia TIRF de disco giratório pode ser uma ferramenta útil para estudar o papel da proteína durante a formação da rede citoesquelletal. Esta técnica permitiu imagens tridimensionais de abordagens celulares rápidas que ocorrem na célula e, ao mesmo tempo, a localização precisa da molécula de fluorescência que são colocadas na membrana plasmática. Este método pode fornecer insights para áreas de pesquisa como microbiologia, biologia celular e todos os ramos onde é importante estudar a interação entre a membrana plasmática e o ambiente celular.
Este método pode ser estendido a esses experimentos de imagem ao vivo onde é importante localizar as estruturas na membrana plasmática e onde você também quer manter uma alta resolução do volume celular restante. As coisas cruciais que se deve considerar são a escolha da linha celular adequada para configurar a iluminação TIRF e os outros parâmetros de imagem e encontrar o foco das células transfeinadas. A demonstração visual deste protocolo certamente ajudaria a evitar problemas com o manuseio das células durante a aquisição de imagens.
Dois dias antes do experimento, as células HELA ou NIH 3T3 em dois mililitros de meio de crescimento total em cada poço de uma placa de cultura celular de seis poços. No dia seguinte, prepare os reagentes de transfecção. Primeiro, diluir um micrograma de RFP Livact e um micrograma de YFP Vinculin em um total de 200 microliters de meio soro reduzido.
Vórtice, o reagente de transfecção brevemente. Em seguida, adicione quatro microliters da mistura a 200 microliters de DNA. Vórtice os reagentes novamente e, em seguida, incubar a mistura de transfecção por 15 a 20 minutos à temperatura ambiente.
Após a incubação, adicione toda a mistura de transfecção diretamente às células. Misture os poços sacudindo a placa e, em seguida, coloque de volta na incubadora. No dia do experimento, prepare a amostra para imagens ao vivo, primeiro revestindo uma antena de fundo de vidro de 35 milímetros com uma solução de 10 microgramas por mililitro de Fibronectina na PBS.
Deixe a solução na superfície do vidro por 30 minutos à temperatura ambiente, depois remova-a e deixe o ar do prato secar. Em seguida, diluir uma solução multi-fluorescente de 0,1 mícade de diâmetro para uma densidade de 1,8 bilhões de partículas por mililitro em água destilada. Adicione a solução à superfície de vidro revestida de fibronectina por 30 a 60 segundos.
Em seguida, remova a solução e deixe o prato secar. O pré-revestimento dos pratos com contas fluorescentes só é necessário por duas razões, primeiro se você quiser encontrar o avião TIRF antes de semear as células ou adquirir uma imagem de contas de duas cores para registro de imagem. Agora prepare um meio de crescimento anti-oxidante adicionando 0,1 solução molar ácido ascórbico em uma concentração final de 0,1 milimolar em meio de crescimento.
Pré-aquecimento da mídia colocando-o em um banho de água de 37 graus Celsius. Em seguida, lave as células com dois mililitros de PBS e adicione 250 microliters de Trypsin EDTA a cada poço da placa. Incubar as células a 37 graus Celsius e esperar de dois a três minutos até que as células estejam totalmente separadas.
Resuspenncie as células cuidadosamente em um mililitro de meio de crescimento anti-oxidante pré-oxidante e adicione-as a mais quatro mililitros do meio em um tubo de cultura de células de 15 mililitros. Coloque a suspensão celular com uma tampa ligeiramente aberta em uma incubadora fixada a 37 graus Celsius tamponada com 5% de dióxido de carbono. Para começar, inicie o controle ambiental do microscópio para alcançar condições estáveis de cultura celular.
Em seguida, coloque o prato de fundo de vidro contendo um mililitro de meio de crescimento anti-oxidante pré-oxidante no suporte de amostra do microscópio pré-aquecido. Em seguida, no software de imagem, configure as configurações de aquisição no microscópio. Ajuste o intervalo de tempo de aquisição para 30 segundos e a duração entre 60 e 90 minutos.
Além disso, ative a função de foco automático do foco automático baseado em hardware para cada ponto de tempo, definindo o valor para um. Agora ajuste a exposição da câmera a 200 milissegundos, o nível de ganho para 500, e a potência laser para 20% para cada canal. Altos níveis de ganho, baixo tempo de exposição e baixa potência laser são recomendados para reduzir a fototoxicidade.
Em seguida, defina a pilha Z para os canais de disco giratório para 10 mícrons com espaçamento de 0,4 mícrons, em seguida, ajuste o deslocamento inferior para zero para que o plano mais baixo seja a posição de foco de foco do hardware automaticamente e desative as pilhas Z para os canais TIRF. Finalmente, ative as posições de estágio de função de vários pontos. Isso permitirá que até três posições sejam registradas em um intervalo de 30 segundos.
Agora encontre as contas fluorescentes com iluminação epifluorescente, ative um canal TIRF e defina o ângulo de iluminação para um valor que denota iluminação TIRF. Em seguida, ative o foco automático pressionando o botão no painel do microscópio e ajuste o foco com a roda de deslocamento. Uma vez em foco, adquira um conjunto de dados de duas cores usando TIRF 488 e TIRF 561 para registro de imagem subsequente baseado em contas.
Remova as células da incubadora e misture a suspensão celular invertendo o tubo fechado duas a três vezes. Em seguida, aplique um mililitro das células na antena de imagem. Encontre rapidamente células transfeinadas duplas com iluminação epifluorescente de baixo nível.
Uma vez encontrado, centralize as células na visualização da câmera ao vivo usando iluminação de campo brilhante e marque a posição. Em seguida, encontre um adicional de um a dois pontos de interesse, salve-os na lista de posições e inicie a aquisição de dados clicando no botão sequência. No início, as células podem facilmente se desprender devido ao movimento do palco, por isso é melhor definir quatro a cinco posições e, posteriormente, descartar uma ou duas.
Para gerar um hipersepilado sem registro em Fiji, primeiro baixe e salve o arquivo fornecido SD-TIRF_helper_jove. ijm nas macros da subpasta fiji. Execute a macro clicando no comando do menu começando com plugins e, em seguida, macros e finalmente executado.
Se os canais de cores precisarem de correção de registro, selecione a opção e crie uma nova referência de registro baseada em contas conhecida como arquivo de referência. Em seguida, importe os dados com o importador de bioformats e escolha o hyperstack como opção de visualização. Carregue o conjunto de dados da imagem, selecione a série de disco giratório na primeira etapa e a série TIRF na segunda etapa.
Neste ponto, Fiji exibirá os dados classificados por posição de canal e estágio. Aplique a correção de inscrição nos respectivos canais carregando o arquivo de referência pré-determinado. Em seguida, selecione a tabela de aparência de cores desejada para cada disco giratório e canal TIRF e mescla-os em um único hiperstack multidimensional.
Durante o processamento das imagens TIRF, um número de planos zed é adicionado ao plano inferior e este número corresponde com o número dos planos nos conjuntos de dados do disco giratório. Isso é muito importante para a representação visual do hipersepilto final. Usando a configuração descrita neste vídeo, células expressas YFP e RFP foram selecionadas e seu processo de adesão observado durante um timelapse de 60 minutos.
Como esperado, as células eram em forma redonda e apenas fracamente aderentes no início com saliências de membrana detectando o ambiente e fazendo contato com o substrato. O contato da matriz celular fortaleceu-se rapidamente após a formação das chamadas aderências nascentes. Com o passar do tempo, os complexos de adesão ampliaram e amadureceram para aderências focais.
Essas estruturas alongadas eram predominantemente aparentes na periferia da célula. Isso resultou de forças exercidas por fibras de actomiose que induziram o fortalecimento das aderências da matriz celular, bem como o agrupamento de fibras de actina. A célula também achatada como resultado da formação da rede actin.
A velocidade de aquisição depende dos seguintes parâmetros, do intervalo de tempo, do tempo de exposição, do número de planos zed e do número de posições. Por isso, é muito importante otimizar esses parâmetros para altas taxas de aquisição. A implementação da mais nova tecnologia de disco giratório transformará a microscopia TIRF de disco giratório em uma nova técnica de microscopia de super resolução que permitirá imagens a altas taxas temporais.
A microscopia de disco giratório é uma técnica muito poderosa para estudar processos que ocorrem entre o interior da célula e a membrana celular. Temos sido mostrados que podemos seguir a dinâmica da vesícula adquirindo pilhas de imagens muito grandes em poucos segundos. A luz laser colidida é perigosa para os olhos.
Nunca olhe diretamente para o feixe e use as precauções de segurança do instrumento para evitar a exposição direta à luz.
