La microscopie TIRF à disque filature peut être un outil utile pour étudier le rôle des protéines pendant la formation du réseau cytosquelettique. Cette technique a permis l’imagerie tridimensionnelle des approches cellulaires rapides qui se produisent dans la cellule et en même temps la localisation précise de la molécule de fluorescence qui sont placées à la membrane plasmatique. Cette méthode peut donner un aperçu de domaines de recherche comme la microbiologie, la biologie cellulaire et toutes les branches où il est important d’étudier l’interaction entre la membrane plasmatique et l’environnement cellulaire.
Cette méthode peut être étendue à ces expériences d’imagerie en direct où il est important de localiser les structures de la membrane plasmatique et où vous voulez également maintenir une haute résolution du volume cellulaire restant. Les choses cruciales que l’on doit considérer sont le choix de la ligne cellulaire appropriée pour configurer l’éclairage TIRF et les autres paramètres d’imagerie et de trouver l’accent des cellules transfectées. La démonstration visuelle de ce protocole permettrait certainement d’éviter les problèmes de manipulation des cellules lors de l’acquisition d’images.
Deux jours avant l’expérience, les graines 3000 cellules HELA ou NIH 3T3 en deux millilitres de milieu de croissance complète dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de six puits. Le lendemain, préparez les reagents transfection. Tout d’abord, diluer un microgramme de DP Livact et un microgramme de vinculine YFP dans un total de 200 microlitres de milieu sérique réduit.
Vortex le reagent transfection brièvement. Ajouter ensuite quatre microlitres du mélange à 200 microlitres d’ADN. Vortex les reagents à nouveau, puis incuber le mélange de transfection pendant 15 à 20 minutes à température ambiante.
Après l’incubation, ajouter l’ensemble du mélange de transfection directement aux cellules. Mélanger les puits en secouant la plaque, puis remettre dans l’incubateur. Le jour de l’expérience, préparez l’échantillon pour l’imagerie en direct en enduire d’abord un plat de fond en verre de 35 millimètres avec une solution de 10 microgrammes par millilitre de fibronectine dans PBS.
Laisser la solution sur la surface vitrée pendant 30 minutes à température ambiante, puis l’enlever et laisser sécher l’air du plat. Ensuite, diluer une solution de perles multi-fluorescentes de 0,1 micron de diamètre à une densité de 1,8 milliard de particules par millilitre dans l’eau distillée. Ajoutez la solution à la surface en verre enduit de fibronectine pendant 30 à 60 secondes.
Retirez ensuite la solution et laissez sécher l’air du plat. La précoating des plats avec des perles fluorescentes n’est nécessaire que pour deux raisons, d’abord si vous voulez trouver le plan TIRF avant d’ensemencer les cellules ou d’acquérir une image de perle bicolore pour l’enregistrement de l’image. Maintenant, préparez un milieu de croissance anti-oxydant en ajoutant 0,1 solution d’acide ascorbique molaire à une concentration finale de 0,1 millimolaire dans le milieu de croissance.
Préjuyons les médias en le plaçant dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules avec deux millilitres de PBS et ajoutez 250 microlitres de Trypsin EDTA à chaque puits de la plaque. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et attendre deux à trois minutes jusqu’à ce que les cellules soient complètement détachées.
Resuspendez soigneusement les cellules en un millilitre de milieu de croissance anti-oxydant préchauré et ajoutez-les à quatre millilitres supplémentaires du milieu dans un tube de culture cellulaire de 15 millilitres. Placez la suspension cellulaire avec un couvercle légèrement ouvert dans un incubateur fixé à 37 degrés Celsius tamponné avec 5% de dioxyde de carbone. Pour commencer, commencer le contrôle environnemental du microscope pour atteindre des conditions stables de culture cellulaire.
Placez ensuite le plat de fond en verre contenant un millilitre de milieu de croissance anti-oxydant préchauffé dans le porte-échantillon du microscope préchauffé. Ensuite, dans le logiciel d’imagerie, configurer les paramètres d’acquisition au microscope. Réglez l’intervalle de temps d’acquisition à 30 secondes et la durée entre 60 et 90 minutes.
En outre, activez la fonction d’autofocus de l’autofocus basé sur le matériel pour chaque point de temps en fixant la valeur à un. Réglez maintenant l’exposition de la caméra à 200 millisecondes, le niveau de gain à 500, et la puissance laser à 20% pour chaque canal. Des niveaux de gain élevés, un faible temps d’exposition et une faible puissance laser sont recommandés pour réduire la phototoxicité.
Ensuite, réglez la pile Z pour les canaux de disque filature à 10 microns avec espacement de 0,4 micron, puis réglez le décalage inférieur à zéro de sorte que le plan le plus bas sera la position de mise au point du matériel autofocus et désactiver les piles Z pour les canaux TIRF. Enfin, activez les positions de l’étape de fonction multi-points. Cela permettra d’enregistrer jusqu’à trois positions sur un intervalle de 30 secondes.
Maintenant, trouvez les perles fluorescentes avec éclairage épifluorescent, activez un canal TIRF et réglez l’angle d’éclairage à une valeur qui dénote l’éclairage TIRF. Ensuite, activez l’autofocus en appuyant sur le bouton du panneau de microscope et ajustez la mise au point avec la roue offset. Une fois au point, acquérir un ensemble de données bicolores à l’aide de TIRF 488 et TIRF 561 pour l’enregistrement d’image basé sur les perles ultérieures.
Retirer les cellules de l’incubateur et mélanger la suspension cellulaire en inversant le tube fermé deux à trois fois. Appliquez ensuite un millilitre des cellules sur le plat d’imagerie. Trouvez rapidement des cellules doublement transfectées avec un éclairage épifluorescent de faible niveau.
Une fois trouvés, centrez les cellules dans l’aperçu de la caméra en direct à l’aide de l’éclairage du champ lumineux et marquez la position. Ensuite, trouvez un à deux points d’intérêt supplémentaires, enregistrez-les sur la liste des positions et commencez l’acquisition de données en cliquant sur le bouton séquence. Au début, les cellules peuvent facilement se détacher en raison du mouvement de la scène, il est donc préférable de définir quatre à cinq positions et plus tard jeter une ou deux.
Afin de générer une hyperstack sans inscription aux Fidji, téléchargez et enregistrez d’abord le fichier fourni SD-TIRF_helper_jove. ijm dans les macros subfolder Fidji. Exécutez la macro en cliquant sur la commande de menu en commençant par les plugins puis les macros et enfin exécuter.
Si les canaux de couleur ont besoin d’une correction d’enregistrement, sélectionnez l’option et créez une nouvelle référence d’enregistrement basée sur les perles connue sous le nom de fichier historique. Ensuite, importez les données avec l’importateur de bioformats et choisissez hyperstack comme option de visualisation. Chargez l’ensemble de données d’image, sélectionnez la série de disques filatures dans la première étape et la série TIRF dans la deuxième étape.
À ce stade, les Fidji afficheront les données triées par canal et position scénique. Appliquez la correction d’enregistrement aux canaux respectifs en chargeant le fichier historique prédéterminé. Sélectionnez ensuite la table de recherche de couleurs désirée pour chaque disque de filature et canal TIRF et fusionnez-les en une seule hyperstack multidimensionnelle.
Pendant le traitement des images TIRF, un certain nombre d’avions zed sont ajoutés au plan inférieur et ce nombre correspond au nombre d’avions dans les ensembles de données de disque filature. C’est très important pour la représentation visuelle de l’hyperstack final. À l’aide de la configuration décrite dans cette vidéo, les cellules exprimant la DP et la DP ont été sélectionnées et leur processus d’adhérence a été observé pendant un timelapse de 60 minutes.
Comme prévu, les cellules étaient de forme ronde et n’adhéraient que faiblement au début avec des saillies membranaires sentant l’environnement et prenant contact avec le substrat. Le contact de matrice cellulaire s’est renforcé rapidement lors de la formation des adhérences dites naissantes. Au fil du temps, les complexes d’adhérence ont agrandi et mûri aux adhérences focales.
Ces structures allongées étaient principalement apparentes à la périphérie de la cellule. Ceci a résulté des forces qui ont été exercées par des fibres d’actomyosin qui ont induit le renforcement des adhérences de matrice cellulaire aussi bien que le regroupement des fibres d’actine. La cellule s’est également aplatie à la suite de la formation du réseau d’actine.
La vitesse d’acquisition dépend des paramètres suivants, de l’intervalle de temps, du temps d’exposition, du nombre d’avions zed et du nombre de positions. Il est donc très important d’optimiser ces paramètres pour des taux d’acquisition élevés. La mise en œuvre de la nouvelle technologie de disque de filature transformera la microscopie tirf de disque de rotation en nouvelle technique de microscopie de super résolution qui permettra l’imagerie à des taux temporels élevés.
La microscopie à disque filature est une technique très puissante pour étudier les processus qui se produisent entre l’intérieur cellulaire et la membrane cellulaire. On nous a montré que nous pouvons suivre la dynamique de la vésicule en acquérant de très grandes piles d’images en quelques secondes. La lumière laser collimée est dangereuse pour les yeux.
Ne jamais regarder directement dans le faisceau et utiliser les précautions de sécurité de l’instrument pour éviter l’exposition directe à la lumière.
