מיקרוסקופיה TIRF דיסק מסתובב יכול להיות כלי שימושי לחקר התפקיד של חלבון במהלך היווצרות רשת cytoskeletal. טכניקה זו אפשרה הדמיה תלת מימדית של גישות תאיות מהירות המתרחשות בתא ובה בעת ובעונה אחת לוקליזציה מדויקת של מולקולת פלואורסצנטיות המוצבת בקרום הפלזמה. שיטה זו יכולה לספק תובנה לתחומי מחקר כמו מיקרוביולוגיה, ביולוגיה של התא, וכל הענפים שבהם חשוב לחקור את האינטראקציה בין קרום הפלזמה לסביבה התאית.
שיטה זו יכולה להיות מורחבת לאותם ניסויי הדמיה חיים שבהם חשוב לוקליזציה של המבנים בממברנת הפלזמה והיכן שאתה גם רוצה לשמור על רזולוציה גבוהה של נפח התא הנותר. הדברים הקריטיים שיש לקחת בחשבון הם הבחירה של קו התא הנכון כדי להגדיר את תאורת TIRF ואת הפרמטרים הדמיה אחרים כדי למצוא את המוקד של תאים מנוקד. ההדגמה החזותית של פרוטוקול זה בהחלט תסייע למנוע בעיות בטיפול בתאים במהלך רכישת תמונה.
יומיים לפני הניסוי, זרע 3, 000 HELA או NIH 3T3 תאים בשני מיליליטר של מדיום צמיחה מלאה לתוך כל באר של צלחת תאים שש באר. למחרת, הכינו את הריג'נטים הטרנס-אדביקים. ראשית, לדלל מיקרוגרם אחד של RFP Livact ומיקרוגרם אחד של YFP וינקולין בסך הכל 200 microliters של מדיום סרום מופחת.
וורטקס הטרנסג'נט בקצרה. לאחר מכן מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של התערובת ל-200 מיקרוליטרים של דנ"א. Vortex reagents שוב ולאחר מכן להחריג את תערובת transfection במשך 15 עד 20 דקות בטמפרטורת החדר.
לאחר הדגירה, מוסיפים את כל תערובת ההיפוגה ישירות לתאים. מערבבים את בארות על ידי טלטול הצלחת ולאחר מכן למקם בחזרה לתוך החממה. ביום הניסוי, להכין את המדגם להדמיה חיה על ידי ציפוי הראשון צלחת תחתונה זכוכית 35 מילימטר עם פתרון 10 מיקרוגרם למיליליטר של פיברונצין ב PBS.
השאירו את הפתרון על משטח הזכוכית במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז הסירו אותו ותנו לאוויר המנה להתייבש. לאחר מכן, לדלל תווי חרוזים רב-פלואורסצנטיים בקוטר 0.1 מיקרון לצפיפות של 1.8 מיליארד חלקיקים למיליליטר במים מזוקקים. הוסיפו את הפתרון למשטח הזכוכית מצופה הפיברונאטין למשך 30 עד 60 שניות.
לאחר מכן להסיר את הפתרון ולתת את האוויר צלחת להתייבש. צבוע מראש של הכלים עם קדימות פלואורסצנטיות נחוץ רק משתי סיבות, תחילה אם אתה רוצה למצוא את המטוס TIRF לפני זריעת התאים או לרכוש תמונת חרוזים דו צבעונית לרישום תמונה. עכשיו להכין מדיום צמיחה נגד חמצון על ידי הוספת 0.1 תווי חומצה אסקורבית טוחנת בריכוז הסופי של 0.1 מילימולר במדיום הצמיחה.
לפני המלחמה התקשורת על ידי הצבתו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS ולהוסיף 250 microliters של טריפסין EDTA לכל באר של הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס ולחכות שתיים עד שלוש דקות עד התאים מנותקים לחלוטין.
תוסיפו את התאים בזהירות למיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון לפני המלחמה ותוסיפו אותם לארבעה מיליליטר נוספים של המדיום בצינור תרבות תאים של 15 מיליליטר. מניחים את ההשעיה התא עם מכסה פתוח מעט באינקובטור להגדיר ב 37 מעלות צלזיוס אגירה עם 5% פחמן דו חמצני. כדי להתחיל, להתחיל את השליטה הסביבתית של המיקרוסקופ כדי להשיג תנאי תרבות תאים יציבים.
לאחר מכן מניחים את המנה התחתונה זכוכית המכילה מיליליטר אחד של מדיום צמיחה נגד חמצון מראש לתוך מחזיק המדגם של מיקרוסקופ שחומם מראש. לאחר מכן, בתוכנת ההדמיה, הגדר את הגדרות הרכישה במיקרוסקופ. הגדר את מרווח זמן הרכישה ל- 30 שניות ואת משך הזמן בין 60 ל- 90 דקות.
כמו כן, הפעל את פונקציית הפוקוס האוטומטי של הפוקוס האוטומטי המבוסס על חומרה עבור כל נקודת זמן על-ידי הגדרת הערך לנקודה אחת. כעת כווננו את החשיפה למצלמה ל-200 אלפיות שנייה, את רמת ההעליה ל-500 ואת עוצמת הלייזר ל-20% עבור כל ערוץ. רמות רווח גבוהות, זמן חשיפה נמוך וכוח לייזר נמוך מומלץ להפחית פוטוטוקסיות.
לאחר מכן, הגדר את מחסנית ה- Z עבור ערוצי הדיסק המסתובב ל- 10 מיקרון עם מרווח של 0.4 מיקרון ולאחר מכן הגדר את ההיסט התחתון לאפס כך שהמישור הנמוך ביותר יהיה מיקום המוקד של פוקוס אוטומטי של החומרה ויהשבית את ערימות ה- Z עבור ערוצי TIRF. לבסוף, הפעל את מיקומי שלב הפונקציות מרובות הנקודות. פעולה זו תאפשר עד שלוש עמדות להירשם על פני מרווח של 30 שניות.
עכשיו למצוא את חרוזים פלואורסצנטיים עם תאורה epifluorescent, להפעיל ערוץ TIRF אחד ולהגדיר את זווית התאורה לערך המציין תאורת TIRF. לאחר מכן, הפעילו את הפוקוס האוטומטי על-ידי לחיצה על הלחצן בלוח המיקרוסקופ והתאימים את המוקד באמצעות גלגל ההיסט. לאחר ההתמקדות, רכוש ערכת נתונים דו-צבעית באמצעות TIRF 488 ו- TIRF 561 לרישום תמונה מבוסס חרוזים עוקב.
מוציאים את התאים מהאינקובטור ומערבבים את מתלי התא על ידי היפוך הצינור הסגור פעמיים עד שלוש פעמים. לאחר מכן להחיל מיליליטר אחד של התאים על צלחת ההדמיה. מצא במהירות תאים מדבקים כפולים עם תאורת אפיפלורסנט ברמה נמוכה.
לאחר שנמצא, מרכז את התאים בתצוגה המקדימה של המצלמה החיה באמצעות תאורת שדה בהיר וסמן את המיקום. לאחר מכן למצוא עוד אחת עד שתי נקודות עניין, לשמור אותם לרשימת הפוזיציות ולהתחיל רכישת נתונים על ידי לחיצה על כפתור הרצף. בהתחלה, התאים יכולים להתנתק בקלות עקב תנועת הבמה ולכן עדיף להגדיר ארבע עד חמש עמדות ומאוחר יותר להשליך אחד או שניים.
על מנת ליצור היפרסטאק ללא רישום בפיג'י, הורד תחילה ושמור את הקובץ שסופק SD-TIRF_helper_jove. ijm בפקודות המאקרו של תיקיית המשנה של פיג'י. הפעל את המאקרו על-ידי לחיצה על פקודת התפריט החל בתוספים ולאחר מכן פקודות מאקרו ולבסוף הפעלה.
אם ערוצי הצבע זקוקים לתיקון רישום, בחרו באפשרות וצורו הפניה חדשה לרישום מבוססת חרוזים הידועה כקובץ ציון דרך. לאחר מכן, יבא את הנתונים עם יבואן הביופורמאטים ובחר בהיפרסטאק כאפשרות צפייה. טען את ערכת נתוני התמונה, בחר את סדרת הדיסקים המסתובבים בשלב הראשון ואת סדרת TIRF בשלב השני.
בשלב זה, פיג'י תציג את הנתונים ממוינים לפי ערוץ ומיקום במה. החל את תיקון הרישום על הערוצים המתאימים על-ידי טעינת קובץ ציון הדרך המוגדר מראש. לאחר מכן בחר את טבלת בדיקת המידע הרצויה עבור כל דיסק מסתובב וערוץ TIRF ומזג אותם לתוך מערכת-יתר רב-מימדית אחת.
במהלך העיבוד של תמונות TIRF, מספר מטוסי zed מתווספים למישור התחתון ומספר זה תואם למספר המישורים בערכות הנתונים של הדיסק המסתובב. זה מאוד חשוב לייצוג החזותי של ההיפרסטאק האחרון. באמצעות ההתקנה המתוארת בסרטון זה, נבחרו תאים מבטאי YFP ו- RFP ותהליך ההיתוך שלהם נצפה במהלך 60 דקות של timelapse.
כצפוי, התאים היו עגולים בצורתם ורק חסידים חלשים בהתחלה עם בלטים ממברנה חשים את הסביבה וצורים קשר עם המצע. מגע מטריצת התא התחזק במהירות עם היווצרות של מה שנקרא הידבקויות המתהווה. במהלך הזמן, מתחמי הידבקות מוגדלים והתבגרו להיתיקים מוקדיים.
מבנים מוארכים אלה ניכרו בעיקר בשולי התא. זה נבע כוחות שהופעלו על ידי סיבי actomyosin אשר גרמו לחיזוק הידבקויות מטריצת התא, כמו גם את הצרור של סיבי actin. התא השתטח גם כתוצאה מהיווצרות רשת Actin.
מהירות הרכישה תלויה בפרמטרים הבאים, במרווח הזמן, בזמן החשיפה, במספר מטוסי zed ובמספר המיקומים. ולכן חשוב מאוד לייעל פרמטרים אלה עבור שיעורי רכישה גבוהים. הטמעת טכנולוגיית הדיסק המסתובבת החדשה ביותר תהפוך מיקרוסקופיה TIRF של דיסק מסתובב לטכניקת מיקרוסקופיה חדשה ברזולוציית-על שתאפשר הדמיה בקצבי זמן גבוהים.
מיקרוסקופ דיסק מסתובב היא טכניקה חזקה מאוד לחקר תהליכים המתרחשים בין פנים התא לבין קרום התא. הוכחנו שאנחנו יכולים לעקוב אחר הדינמיקה של עניין על ידי רכישת ערימות תמונה גדולות מאוד בתוך שניות ספורות. אור לייזר נאסף מסוכן לעיניים.
לעולם אל תסתכל ישירות לתוך הקרן ולהשתמש באמצעי הבטיחות של המכשיר, כדי למנוע חשיפה ישירה לאור.
