회전 디스크 TIRF 현미경 검사는 사이토스켈레탈 네트워크 형성 중 단백질의 역할을 연구하는 데 유용한 도구가 될 수 있습니다. 이 기술은 세포에서 생기는 빠른 세포 접근의 3 차원 화상 진찰을 허용하고 혈장 막에 놓인 형광 분자의 정확한 현지화. 이 방법은 미생물학, 세포 생물학 및 플라즈마 막과 세포 환경 사이의 상호 작용을 연구하는 것이 중요한 모든 분기와 같은 연구 영역에 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 방법은 플라즈마 멤브레인의 구조를 지역화하는 것이 중요하고 나머지 세포 부피의 고해상도를 유지하려는 라이브 이미징 실험으로 확장 될 수 있습니다. 고려해야 할 중요한 것은 TIRF 조명 및 다른 이미징 매개 변수를 설정하고 전염된 세포의 초점을 찾기 위해 적절한 세포주 선택입니다. 이 프로토콜의 시각적 데모는 이미지 수집 중에 셀 처리문제를 방지하는 데 확실히 도움이 될 것입니다.
실험 이틀 전, 종자 3, 000 HELA 또는 NIH 3T3 세포는 6웰 세포 배양판의 각 웰에 전체 성장 배지의 2밀리리터로 한다. 다음 날, 트랜스페트 시약을 준비합니다. 첫째, RFP Livact의 마이크로그램 1개와 YFP Vinculin의 마이크로그램 1개를 총 200마이크로리터의 감소된 혈청 배지에 희석시 희석시.
간질 시약을 잠시 소용돌이. 그런 다음 혼합물의 4 개의 마이크로 리터를 DNA 의 200 마이크로 리터에 추가합니다. 시약을 다시 소용돌이게 한 다음 실온에서 15~20분 동안 배양 혼합물을 배양합니다.
배양 후 전체 경질 믹스 드롭 와이즈를 세포에 직접 추가합니다. 접시를 흔들어 우물을 섞은 다음 인큐베이터에 다시 넣습니다. 실험 당일, PBS의 밀리리터 용액 당 10 마이크로그램으로 35mm 유리 바닥 접시를 먼저 코팅하여 라이브 이미징 샘플을 준비합니다.
실온에서 30분 동안 유리 표면에 용액을 두은 다음 제거하고 접시공기를 건조시키십시오. 다음으로, 증류수의 밀리리터당 18억 개의 입자의 밀도로 0.1 미크론 직경다형 비드 용액을 희석시켰다. 30~60초 동안 Fibronectin 코팅 유리 표면에 용액을 추가합니다.
그런 다음 용액을 제거하고 접시 공기가 건조하게하십시오. 형광 구슬로 접시의 사전 코팅은 두 가지 이유로만 필요하며, 먼저 세포를 시드하기 전에 TIRF 평면을 찾거나 이미지 등록을위한 두 가지 색 비드 이미지를 획득하려는 경우. 이제 성장 배지에서 0.1 밀리머의 최종 농도에서 0.1 어금니 아스코르브 산 용액을 첨가하여 산화 방지 성장 배지를 준비한다.
37도 의 수조에 배치하여 미디어를 미리 따뜻하게하십시오. 다음으로, PBS의 2 밀리리터로 세포를 세척하고 접시의 각 우물에 트립신 EDTA의 250 마이크로 리터를 추가합니다. 섭씨 37도에서 세포를 배양하고 세포가 완전히 분리 될 때까지 2 ~ 3 분 기다립니다.
전동 된 산화 성장 배지의 1 밀리 리터에서 세포를 주의 깊게 중단하고 15 밀리 리터 세포 배양 튜브에서 배지의 추가 4 밀리리터에 추가. 셀 서스펜션을 5%의 이산화탄소로 완충한 섭씨 37도로 설정된 인큐베이터에 약간 열린 뚜껑을 놓습니다. 먼저, 안정적인 세포 배양 조건을 달성하기 위해 현미경의 환경 제어를 시작합니다.
그런 다음 예온된 현미경의 샘플 홀더에 예온 된 산화 방지 성장 배지의 1 밀리리터를 포함하는 유리 바닥 접시를 놓습니다. 다음으로, 이미징 소프트웨어에서 현미경으로 획득 설정을 설정합니다. 획득 시간 간격을 30초로 설정하고 지속 시간을 60분에서 90분 사이로 설정합니다.
또한 값을 하나로 설정하여 매 시간 마다 하드웨어 기반 자동 초점의 자동 초점 기능을 활성화합니다. 이제 카메라 노출을 200밀리초로 조정하고 게인 레벨을 500으로 조정하고 레이저 전원을 모든 채널에 대해 20%로 조정합니다. 높은 게인 수준, 낮은 노출 시간 및 낮은 레이저 전력광 독성을 줄이기 위해 권장 됩니다.
그런 다음 회전 디스크 채널의 Z 스택을 0.4 미크론 간격으로 10미크론으로 설정한 다음 하단 오프셋을 0으로 설정하여 가장 낮은 평면이 하드웨어 자동 초점의 초점 위치가 되고 TIRF 채널의 Z 스택을 비활성화합니다. 마지막으로 다중 점 함수 스테이지 위치를 활성화합니다. 이렇게 하면 30초 간격으로 최대 3개의 위치를 기록할 수 있습니다.
이제 형광 구슬을 상피 조명으로 찾고, 하나의 TIRF 채널을 활성화하고, TIRF 조명을 나타내는 값으로 조명 각도를 설정합니다. 다음으로 현미경 패널의 버튼을 눌러 자동 초점을 활성화하고 오프셋 휠로 초점을 조정합니다. 포커스가 되면 후속 비드 기반 이미지 등록을 위해 TIRF 488 및 TIRF 561을 사용하여 2색 데이터 집합을 획득합니다.
인큐베이터에서 세포를 제거하고 폐쇄 된 튜브를 2 ~ 3 번 반전하여 세포 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 세포의 1 밀리리터를 이미징 접시에 바그러 주세요. 낮은 수준의 상피 성광 조명을 가진 이중 전형 세포를 빨리 찾아보십시오.
일단 발견되면, 밝은 필드 조명을 사용하여 라이브 카메라 미리 보기에서 셀을 중앙화하고 위치를 표시합니다. 그런 다음 관심 지점1~2점을 추가로 찾아 위치 목록에 저장하고 시퀀스 버튼을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 처음에, 세포는 쉽게 단계 운동으로 인해 분리 할 수 있으므로 4 ~ 5 개의 위치를 설정하고 나중에 하나 또는 두 개의 위치를 폐기하는 것이 좋습니다.
피지에서 등록 무료 하이퍼 스택을 생성하기 위해, 먼저 다운로드하고 제공된 파일 SD-TIRF_helper_jove 저장합니다. 피지 서브 폴더 매크로에서 ijm. 플러그인으로 시작하여 매크로를 클릭하고 마지막으로 실행하여 매크로를 실행합니다.
색상 채널에 등록 수정이 필요한 경우 옵션을 선택하고 랜드마크 파일이라고 하는 새 비드 기반 등록 참조를 만듭니다. 다음으로, 바이오포맷 가져오기로 데이터를 가져오고 하이퍼스택을 보기 옵션으로 선택합니다. 이미지 데이터 세트를 로드하고, 첫 번째 단계에서 회전 디스크 시리즈와 두 번째 단계에서 TIRF 계열을 선택합니다.
이 시점에서 피지는 채널 및 스테이지 위치에 의해 정렬 된 데이터를 표시합니다. 미리 결정된 랜드마크 파일을 로드하여 각 채널에 등록 수정을 적용합니다. 그런 다음 회전하는 모든 디스크 및 TIRF 채널에 대해 원하는 색상 조회 테이블을 선택하고 단일 다차원 하이퍼 스택으로 병합합니다.
TIRF 이미지를 처리하는 동안 여러 개의 zed 평면이 하단 평면에 추가되고 이 숫자는 회전하는 디스크 데이터 집합의 평면 수와 일치합니다. 이는 최종 하이퍼스택의 시각적 표현에 매우 중요합니다. 이 비디오에 설명된 설정을 사용하여 YFP 및 RFP 표현 셀을 선택하고 60분 의 타임랩스 동안 그들의 접착 과정을 관찰하였다.
예상대로, 세포는 둥근 모양이었고, 환경을 감지하고 기판과 접촉하는 막 돌출부로 처음에 약하게 부착되었다. 세포 매트릭스 접촉은 소위 초기 접착의 형성시 신속하게 강화. 시간이 지남에 따라 유착 복합체는 초점 접착력으로 확대되고 성숙되었습니다.
이 길쭉한 구조물은 세포의 주변에 주로 명백했습니다. 이것은 세포 매트릭스 접착력의 강화뿐만 아니라 액틴 섬유의 번들뿐만 아니라 유도 actomyosin 섬유에 의해 가해진 힘에서 유래했다. 세포는 또한 액틴 네트워크 형성의 결과로 평평해졌다.
획득 속도는 다음 매개 변수, 시간 간격, 노출 시간, zed 평면 수 및 위치 수에 따라 달라집니다. 따라서 높은 획득 률에 대해 이러한 매개 변수를 최적화하는 것이 매우 중요합니다. 최신 방적 디스크 기술의 구현은 회전 디스크 TIRF 현미경 검사법을 높은 시간적 속도로 이미징을 허용하는 새로운 초해상도 현미경 기술로 바꿔놓을 것입니다.
회전 디스크 현미경 검사는 세포 내부와 세포막 사이에 발생하는 프로세스를 연구하기위한 매우 강력한 기술이다. 우리는 몇 초 이내에 매우 큰 이미지 스택을 획득하여 소포의 역학을 따를 수 있음을 보여 주었다. 콜라주 레이저 빛은 눈에 위험합니다.
빔을 직접 들여다보지 말고 직접 광 노출을 피하기 위해 계측기의 안전 예방 조치를 사용하지 마십시오.
