Die Spinnscheibe TIRF-Mikroskopie kann ein nützliches Werkzeug sein, um die Rolle von Protein während der Bildung des zytoskelettalen Netzwerks zu untersuchen. Diese Technik ermöglichte eine dreidimensionale Bildgebung schneller zellulärer Ansätze, die in der Zelle auftreten, und gleichzeitig die präzise Lokalisierung von Fluoreszenzmolekülen, die an der Plasmamembran platziert werden. Diese Methode kann Einblicke in Forschungsbereiche wie Mikrobiologie, Zellbiologie und all jene Zweige geben, in denen es wichtig ist, die Wechselwirkung zwischen der Plasmamembran und der zellulären Umgebung zu untersuchen.
Diese Methode kann auf live-bildgebende Experimente ausgedehnt werden, bei denen es wichtig ist, die Strukturen in der Plasmamembran zu lokalisieren und wo Sie auch eine hohe Auflösung des verbleibenden Zellvolumens beibehalten möchten. Die entscheidenden Dinge, die man berücksichtigen muss, sind die Wahl der richtigen Zelllinie, um die TIRF-Beleuchtung und die anderen bildgebenden Parameter einzurichten und den Fokus der transfizierten Zellen zu finden. Die visuelle Demonstration dieses Protokolls würde sicherlich dazu beitragen, Probleme mit dem Umgang mit den Zellen während der Bildaufnahme zu vermeiden.
Zwei Tage vor dem Experiment samen 3.000 HELA- oder NIH 3T3-Zellen in zwei Millilitern Vollwachstumsmedium in jeden Brunnen einer Sechs-Well-Zellkulturplatte. Am nächsten Tag die Transfektionsreagenzien vorbereiten. Verdünnen Sie zunächst ein Mikrogramm RFP Livact und ein Mikrogramm YFP-Vinculin in insgesamt 200 Mikroliter reduziertem Serummedium.
Wirbel das Transfektionsreagenz kurz. Dann fügen Sie vier Mikroliter der Mischung zu 200 Mikroliter DNA. Die Reagenzien wieder vortexen und dann die Transfektionsmischung 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Nach der Inkubation fügen Sie die gesamte Transfektionsmischung tropfenweise direkt zu den Zellen hinzu. Mischen Sie die Brunnen, indem Sie die Platte schütteln und dann wieder in den Inkubator legen. Bereiten Sie am Tag des Experiments die Probe für die Live-Bildgebung vor, indem Sie zunächst eine 35-Millimeter-Glasbodenschale mit einer 10-Mikrogramm-Pro-Milliliter-Lösung von Fibronectin in PBS beschichten.
Lassen Sie die Lösung auf der Glasoberfläche für 30 Minuten bei Raumtemperatur dann entfernen und lassen Sie die Schale Luft trocknen. Als nächstes verdünnen Sie eine Multifluoreszenz-Perlenlösung mit einem Durchmesser von 0,1 Mikron auf eine Dichte von 1,8 Milliarden Partikeln pro Milliliter in destilliertem Wasser. Fügen Sie die Lösung 30 bis 60 Sekunden lang auf die Fibronectin-beschichtete Glasoberfläche ein.
Dann entfernen Sie die Lösung und lassen Sie die Schale Luft trocknen. Die Vorbeschichtung der Schalen mit fluoreszierenden Perlen ist nur aus zwei Gründen erforderlich, zunächst, wenn Sie die TIRF-Ebene vor dem Aussäen der Zellen finden oder ein zweifarbiges Perlenbild für die Bildregistrierung erwerben möchten. Bereiten Sie nun ein antioxidatives Wachstumsmedium vor, indem Sie 0,1 molare Ascorbinsäurelösung bei einer Endkonzentration von 0,1 Millimolar im Wachstumsmedium hinzufügen.
Die Medien vorwärmen, indem Sie sie in ein 37 Grad Celsius Wasserbad legen. Als nächstes waschen Sie die Zellen mit zwei Milliliter PBS und fügen Sie 250 Mikroliter Trypsin EDTA zu jedem Brunnen der Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius und warten Sie zwei bis drei Minuten, bis die Zellen vollständig getrennt sind.
Setzen Sie die Zellen sorgfältig in einem Milliliter vorgewärmten antioxidierenden Wachstumsmedium aus und fügen Sie sie zu weiteren vier Millilitern des Mediums in einem 15 Milliliter Zellkulturrohr hinzu. Legen Sie die Zellsuspension mit einem leicht geöffneten Deckel in einen Inkubator, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, gepuffert mit 5% Kohlendioxid. Beginnen Sie zunächst mit der Umweltkontrolle des Mikroskops, um stabile Zellkulturbedingungen zu erreichen.
Dann legen Sie die Glasbodenschale mit einem Milliliter vorgewärmten antioxidierenden Wachstumsmedium in den Probenhalter des vorgeheizten Mikroskops. Als nächstes richten Sie in der Bildgebungssoftware die Erfassungseinstellungen am Mikroskop ein. Legen Sie das Erfassungszeitintervall auf 30 Sekunden und die Dauer auf 60 bis 90 Minuten fest.
Aktivieren Sie außerdem die Autofokus-Funktion des hardwarebasierten Autofokus für jeden Zeitpunkt, indem Sie den Wert auf einen Wert festlegen. Stellen Sie nun die Kamerabelichtung auf 200 Millisekunden, die Verstärkungsstufe auf 500 und die Laserleistung auf 20 % für jeden Kanal ein. Hohe Verstärkungswerte, geringe Belichtungszeit und geringe Laserleistung werden empfohlen, um die Phototoxizität zu reduzieren.
Als Nächstes stellen Sie den Z-Stack für die sich drehenden Festplattenkanäle auf 10 Mikrometer mit 0,4 Mikron Abstand ein, und stellen Sie dann den unteren Offset auf Null ein, sodass die unterste Ebene die Fokusposition des Hardware-Autofokus ist, und deaktivieren Sie die Z-Stacks für die TIRF-Kanäle. Aktivieren Sie schließlich die Multi-Point-Funktionsstufenpositionen. Dadurch können bis zu drei Positionen über ein 30-Sekunden-Intervall aufgezeichnet werden.
Finden Sie nun die fluoreszierenden Perlen mit epifluoreszierender Beleuchtung, aktivieren Sie einen TIRF-Kanal und stellen Sie den Beleuchtungswinkel auf einen Wert ein, der die TIRF-Beleuchtung bezeichnet. Aktivieren Sie als Nächstes den Autofokus, indem Sie die Taste am Mikroskoppanel drücken und den Fokus mit dem Offsetrad einstellen. Sobald Sie im Fokus sind, erwerben Sie einen zweifarbigen Datensatz mit TIRF 488 und TIRF 561 für die nachfolgende perlenbasierte Bildregistrierung.
Entfernen Sie die Zellen aus dem Inkubator und mischen Sie die Zellsuspension, indem Sie das geschlossene Rohr zwei- bis dreimal invertieren. Dann einen Milliliter der Zellen auf die bildgebende Schale auftragen. Finden Sie schnell doppeltransfizierte Zellen mit niedriger epifluoreszierender Beleuchtung.
Sobald sie gefunden wurden, zentrieren Sie die Zellen in der Live-Kameravorschau mithilfe von Hellfeldbeleuchtung und markieren Sie die Position. Dann finden Sie ein bis zwei weitere Sehenswürdigkeiten, speichern Sie sie in der Positionsliste und beginnen Sie mit der Datenerfassung, indem Sie auf die Sequenzschaltfläche klicken. Am Anfang können sich die Zellen aufgrund der Bühnenbewegung leicht lösen, so dass es besser ist, vier bis fünf Positionen festzulegen und später ein oder zwei zu verwerfen.
Um einen registrierungsfreien Hyperstack in Fidschi zu generieren, laden Sie zuerst die bereitgestellte Datei SD-TIRF_helper_jove herunter und speichern Sie sie. ijm in den Unterordnermakros Fidschi. Führen Sie das Makro aus, indem Sie auf den Menübefehl klicken, der mit Plugins, dann Makros beginnt und schließlich ausgeführt wird.
Wenn die Farbkanäle eine Registrierungskorrektur benötigen, wählen Sie die Option aus, und erstellen Sie eine neue, auf Perlen basierende Registrierungsreferenz, die als Landmark-Datei bezeichnet wird. Importieren Sie als Nächstes die Daten mit dem Bioformat-Importer, und wählen Sie hyperstack als Anzeigeoption. Laden Sie den Bilddatensatz, wählen Sie im ersten Schritt die rotierende Plattenserie und im zweiten Schritt die TIRF-Serie aus.
An diesem Punkt zeigt Fidschi die Daten nach Kanal und Bühnenposition sortiert an. Wenden Sie die Registrierungskorrektur auf die jeweiligen Kanäle an, indem Sie die vorgegebene Landmark-Datei laden. Wählen Sie dann die gewünschte Farbsuchtabelle für jede sich drehende Scheibe und jeden TIRF-Kanal aus und verschmelzen Sie sie zu einem einzigen mehrdimensionalen Hyperstack.
Während der Verarbeitung der TIRF-Bilder wird der unteren Ebene eine Reihe von zed-Ebenen hinzugefügt, und diese Zahl stimmt mit der Anzahl der Ebenen in den sich drehenden Festplattendatensätzen überein. Das ist sehr wichtig für die visuelle Darstellung des letzten Hyperstacks. Anhand des in diesem Video beschriebenen Setups wurden YFP- und RFP-extierende Zellen ausgewählt und ihr Haftprozess während eines 60-minütigen Zeitraffers beobachtet.
Wie erwartet, waren die Zellen rund geformt und nur schwach haftend am Anfang mit Membranvorsprüngen, die die Umwelt erfassen und Kontakt mit dem Substrat herstellen. Zellmatrixkontakt verstärkt sich schnell bei Bildung sogenannter aufkeimender Adhäsionen. Im Laufe der Zeit vergrößerten sich Haftkomplexe und reiften zu fokalen Adhäsionen.
Diese länglich anlegten Strukturen waren überwiegend am Rand der Zelle zu erkennen. Dies resultierte aus Kräften, die durch Actomyosinfasern ausgeübt wurden, die die Stärkung der Zellmatrixadhäsionen sowie die Bündelung von Aktinfasern induzierten. Die Zelle flachte auch als Folge der Aktin-Netzwerkbildung ab.
Die Erfassungsgeschwindigkeit ist abhängig von den folgenden Parametern, dem Zeitintervall, der Belichtungszeit, der Anzahl der zed Ebenen und der Anzahl der Positionen. Daher ist es sehr wichtig, diese Parameter für hohe Akquisitionsraten zu optimieren. Die Implementierung der neuesten Spinnscheibentechnologie wird die Spinnscheibe TIRF-Mikroskopie in eine neue Superauflösungsmikroskopie-Technik verwandeln, die bildgebende Aufnahmen mit hohen zeitlichen Raten ermöglicht.
Die Spinnscheibenmikroskopie ist eine sehr leistungsfähige Technik zum Studium von Prozessen, die zwischen dem Zellinneren und der Zellmembran auftreten. Uns wurde gezeigt, dass wir der Dynamik des Vesikels folgen können, indem wir innerhalb weniger Sekunden sehr große Bildstapel erwerben. Kollimiertes Laserlicht ist gefährlich für die Augen.
Schauen Sie niemals direkt in den Strahl und verwenden Sie die Sicherheitsvorkehrungen des Geräts, um eine direkte Lichteinwirkung zu vermeiden.
