该方法允许在天然脂质双层环境中研究呼吸膜酶（如细胞色素BO3）的质子传输活性。这种单一酶技术的主要优点是有可能开始和停止酶反应在任何时刻使用电化学。使用玻璃注射器将200微升氯仿从大肠杆菌中提取的脂质极性提取物转移到玻璃瓶中，制成5毫克等同。
将50微升，每毫升一毫克，在脂质中加入10微升，使1至100比10的泛素10与脂质的最终比例。在混合物中加入20微升，每毫升长波长度1毫克的荧光染料，标有脂质缩写FDLL。通过短涡使氯仿溶液均质，并在温和的氮气或砷流下蒸发大部分氯仿。
完全去除氯仿痕迹，在真空下进一步蒸发至少一小时。加入 312.5 微升 40 毫摩尔 MOPS pH 7.4 缓冲液到一个脂质泛素 10 FDLL 干混合。混合涡流，直到脂质膜完全重新悬浮，然后两分钟在超声波浴中治疗。
接下来加入125微升25毫摩尔HPTS，一种pH敏感荧光染料，将封装在脂质体内。现在添加 137.5 微升 250 毫摩尔 OGP 表面活性剂。使用涡流混合后，在超声波水浴中对混合物进行声波处理10分钟，以确保所有脂质都溶解成表面活性色球。
然后将分散体转移到1.5毫升塑料管中。加入所需的细胞色素 BO3 量，并加入超纯水，使总体积达到 50 微升。在4摄氏度下在滚筒搅拌机上孵育重组混合物10分钟。
接下来，在两个1.5毫升管盖中，每个都重50毫克聚苯乙烯微珠。然后将 100 毫克聚苯乙烯微珠重到另外两个 1.5 毫升管盖中。用石蜡膜合上瓶盖，防止干燥。
将前 50 毫克聚苯乙烯微珠加入重组混合物中，将带聚苯乙烯微珠的盖子放在 1.5 毫升塑料管上，并准备好的分散剂。然后执行短旋转几秒钟，将微珠带到管的底部。在滚筒搅拌机上孵育4摄氏度的悬浮液，使聚苯乙烯微珠吸收表面活性剂30分钟。
重复添加聚苯乙烯微珠和孵育，如下所示。加入50毫克微珠，进行60分钟的孵育。然后加入100毫克微珠，进行60分钟的孵育。
最后，加入100毫克微珠进行120分钟的孵育。使用带薄尖端的微管将蛋白糖体溶液与聚苯乙烯微珠分离。稀释 TI 45 超离心管中 90 毫升 MOPS 缓冲液中的分散。
使用 45 TI 转子在 125，000 次 G 下进行超离射一小时，以对蛋白体进行颗粒化。超离心后，丢弃上清液，用 MOPS 缓冲液冲洗颗粒，无需重新暂停颗粒。丢弃冲洗缓冲液后，在将悬浮液转移到 1.5 毫升塑料管之前，将悬浮在 500 微升 MOPS 缓冲液中，用薄尖微管来回移液。
在12，000次G下离心5分钟后，将上经液（即重组的蛋白酶体）转移到一个新的小瓶中。使用双组分低荧光环氧树脂将多达九个玻璃盖粘在蒸发的黄金表面。在80摄氏度下固化胶水4小时。
在使用自组装的单层进行修改之前，用刀片将玻璃盖滑从硅胶晶圆上分离。由于盖滑件很薄，拆卸盖滑时应小心，不要破裂或打破玻璃滑梯。将刚分离的镀金涂层滑入 6 马卡普托赫萨醇溶液中，在 20 至 25 摄氏度下过夜，形成自组装的单层。
第二天，从溶液中去除镀金盖滑，用水或甲醇短暂清洗，然后用异丙醇清洗。在温和的气流下干燥镀金盖滑。如文本协议所示，将镀金盖滑在光谱电化学电池中组装。
在橡胶 O 环定义的区域外用扁平导线与黄金接触，并拧紧其顶部的电化学电池。加入两毫升电解质缓冲液，并将参考电极和辅助电极放在电池中。继续检查自组装单层的质量，并运行文本协议中描述的空白。
以每毫升0.5毫克最终脂质浓度向电化学细胞中加入蛋白糖体，并稍微与移液器混合。在室温下等待 30 到 60 分钟，直到电极表面的蛋白体体吸收完成。通过更换缓冲液至少 10 次来清洗电池，但避免使电极表面完全干燥。
现在，在开放细胞电位下运行电化学阻抗光谱，以确认金电极上自组装的单层保持不变。运行循环伏特图，扫描速率为10和100毫伏/秒，以观察细胞色素BO3在电化学奎诺还原的启动潜力下进行泛醇氧化和氧减少。修改金电极一样，但使用五微克每毫升蛋白糖体。
对于单酶研究，将细胞色素BO3与脂质比降至0.1至0.2%之间，将浸入油滴，然后在倒置荧光显微镜的60倍油量目标上放置电化学细胞。使用适当的FDLL荧光滤波器，聚焦电极表面。单脂体应作为显微镜目标衍射极限的亮点出现。
以 FDLL 花光的图像。切换到显微镜上的 HPTS 荧光滤光片集，以验证 HTPS 荧光是否清晰可见，并且与背景有区别。如果不是这样，增加光强。
通过交替两个HTPS滤波器集对显微镜软件进行编程，以执行定时图像采集。为此，请设置一秒曝光，然后导航到菜单应用程序。然后定义/运行 ND 采集并选择两个 HTPS 通道。
将图像采集之间的延迟设置为最小。在此实验中，使用 0.3 秒延迟和 5 分钟的总持续时间。调整电位设置以更改图像采集过程中的潜力，如文本协议中所示。
现在，通过同时手动启动两个测量，在显微镜上同时运行时间图像采集和电位统计中的潜在序列。此处显示的荧光图像是三个不同覆盖范围在电极上吸收的脂质体。含有脂质体的染料在图像上可见为亮点。
图像的中心部分被照片漂白，以揭示背景荧光水平。两个 HTPS 通道上的图像是超级不可假定的，其中两个通道之间的比率对应于本实验中使用的 pH 值 7.4。FDLL 通道可以看到更多的脂质体，表示存在没有 HPTS 封装的脂质体。
HPTS 和 FDLL 通道之间的差异在高覆盖范围下更为明显。可能是因为在高脂质体覆盖时，脂质体更容易在表面破裂或熔断。在这里，在实验的300秒内，两个HTPS通道上的脂体花数的变化显示为相应区域的3D曲面图。
还原电位在 60 秒到 180 秒之间应用。显示了两个 HPTS 通道与时间之间的体积公制强度比的相应图。此处显示的是当细胞色素 BO3 含量为 1.3% 时，单个图像中所有囊泡 pH 值变化的中位数，当应用 0.1 和 0.3 伏特之间的电位时，pH 值的增加清晰可见。
当细胞色素 BO3 含量低得多 0.1% 时，中位曲线与空脂质体曲线几乎无法区分。确保从脂质体分布中完全去除表面活性剂非常重要，因为残余体可能会增加脂质体对质子的渗透性。这些方法使我们能够对天然嗜脂奎诺基质提出具体问题，与经常使用的水溶性奎诺类比相反。
此外，单一酶实验确定了以前未知的泄漏状态，其中蛋白质充当质子通道，质子可以自由向后流动。
