Этот метод позволяет изучать протонную транспортную активность ферментов дыхательных мембран, таких как цитохром BO3, в естественной липидной двухслойной среде. Основным преимуществом этой единственной ферментной техники является возможность запуска и остановки ферментативных реакций в любой момент с помощью электрохимии. Использование стеклянного шприца передачи 200 микролитров хлороформного запаса липидного полярного экстракта из кишечной палочки в стеклянные флаконы, чтобы сделать пять миллиграммовых алицитов.
Добавьте 50 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр убихинона 10 к липидам, чтобы сделать окончательное соотношение от одного до 100 убихинона 10 к липидам. К смеси добавить 20 микролитров по одному миллиграмму на миллилитр длинноволнового флуоресцентного красителя с надписью lipid сокращенно FDLL. Гомогенизировать раствор хлороформа коротким вихрем и испарять большую часть хлороформа под нежным потоком азота или аргона.
Удалите следы хлороформа полностью путем дальнейшего испарения под вакуумом, по крайней мере один час. Добавьте 312,5 микролитров 40 миллимолярной MOPS pH 7.4 буфера к одной алиците липидов убихинона 10 FDLL сухой смеси. Смешайте вихрь до липидной пленки полностью повторно приостановлено следуют две минуты лечения в ультразвуковой ванне.
Далее добавьте 125 микролитров 25 миллимолярной HPTS, чувствительный рН флуоресцентный краситель, который будет инкапсулирован внутри липосом. Теперь добавьте 137,5 микролитров 250 миллимолярный OGP сурфактант. После смешивания с помощью вихря, sonicate смесь в ультразвуковой водяной бане в течение 10 минут, чтобы обеспечить все липиды solubilized в сурфактант micelles.
Затем перенесите дисперсию в пластиковую трубку на 1,5 миллилитров. Добавьте необходимое количество цитохрома BO3 и добавьте ультра чистую воду, чтобы сделать общий объем 50 микролитров. Инкубировать смесь восстановления при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут на роликовом миксере.
Следующий вес 50 миллиграммов полистирола микробусы в каждом из двух 1,5 миллилитров трубки шапки. Затем взвесить 100 миллиграммов полистирола микробусы в еще два 1,5 миллилитров трубки шапки. Закройте колпачки парафиновой пленкой, чтобы предотвратить высыхание.
Добавьте первые 50 миллиграммов полистирола микробусы в смесь восстановления, поставив крышку с полистирола микробусы на 1,5 миллилитров пластиковой трубки с подготовленной дисперсии. Затем выполните короткий спин в течение нескольких секунд, чтобы принести микробусы на дно трубки. Инкубировать подвеску при четырех градусах по Цельсию на ролик смеситель, чтобы полистирол микробусы поглощать сурфактант в течение 30 минут.
Повторите добавления полистирола микробусы и инкубации следующим образом. Добавьте 50 миллиграммов микробусов в течение 60 минут инкубации. Затем добавьте 100 миллиграммов микробусов в течение 60 минут инкубации.
И, наконец, добавить 100 миллиграммов микробусов в течение 120 минут инкубации. Отделить протеолипосомный раствор от полистирола микробусы с помощью микропипета с тонким кончиком. Разбавить дисперсию в 90 миллилитров буфера MOPS в TI 45 ультрацентрифуг трубки.
Ультрацентрифуг дисперсии с использованием ротора типа 45 TI при 125 000 раз G в течение одного часа, чтобы гранулировать протеолипосомы. После ультрацентрифугации отбросьте супернатант и промойте гранулы буфером MOPS, не перерасходуя гранулы. После отбрасывания полоскания буфера, повторно приостановить протеолипосомы в 500 микролитров буфера MOPS путем трубопроводов его туда и обратно с тонким наконечником micropipette перед передачей подвески на 1,5 миллилитров пластиковой трубки.
После центрифугации в течение пяти минут в 12 000 раз G, чтобы удалить мусор, передать супернатант, который является восстановленным proteoliposomes в новый флакон. Клей до девяти стеклянный покров скользит на испаряется золотая поверхность с помощью двухкомпонентных низкофлуоресценции эпоксидной смолы. Лечить клей при 80 градусах по Цельсию в течение четырех часов.
Незадолго до модификации с самосборкой монослоя, отсоедините стеклянную крышку скользит от силиконовых пластин с лезвием. Из-за тонкости крышки скользит, заботиться при отсоединения крышки скользит, чтобы не трещины или разбить стеклянные слайды. Dip свежеотдельный позолоченный покрытием крышка скользит в 6-marcaptohexanol раствор и оставить при 20 до 25 градусов по Цельсию на ночь, чтобы сформировать самостоятельно собранный монослой.
На следующий день, удалить покрытие с золотым покрытием скользит от раствора и мыть кратко с водой или метанолом, а затем с изопропанолом. Сухая крышка с золотым покрытием скользит под нежным потоком газа. Соберите крышку с золотым покрытием в спектро-электрохимическую ячейку, как это показано в текстовом протоколе.
Установить контакт с золотом с плоской проволокой за пределами области определяется резиновым O-кольцо и плотно винт вниз электрохимической ячейки на верхней части его. Добавьте два миллилитров электролитного буферного раствора и поместите в ячейку эталонные и вспомогательные электроды. Приступайте к проверке качества самостоятельно собранного монослоя и запускайте пробелы, описанные в текстовом протоколе.
Добавить протеолипосомы в электрохимическую клетку при 0,5 миллиграмма на миллилитр конечной концентрации липидов и слегка смешать с пипеткой. Подождите от 30 до 60 минут при комнатной температуре, пока поглощение протеолипосом на поверхности электрода не будет закончено. Вымойте ячейку, изменив буферный раствор по крайней мере 10 раз, но не оставляйте поверхность электрода полностью сухой.
Теперь запуск электрохимической спектроскопии на открытой клеточной потенциале для подтверждения самосборного монослоя на золотом электроде остается неизменным. Запуск циклических вольтамммограмм со скоростью сканирования 10 и 100 милливольт в секунду для наблюдения каталатической окисления убихинола и сокращения кислорода цитохром bo3 при наступлении потенциалов электрохимического сокращения хинона. Измените золотой электрод, как и раньше, но используя пять микрограммов на миллилитр протеолипосомы.
Для одного фермента исследования уменьшить цитохром BO3 к липидное соотношение между 0,1 и 0,2%Поместите каплю масла погружения, а затем электрохимической клетки на 60 раз масляной цели перевернутой флуоресценции микроскопа. Используя соответствующие фильтры для флуоресценции FDLL, сосредоточьтесь на поверхности электрода. Одиночные липосомы должны появляться как яркие пятна на пределе дифракции цели микроскопа.
Сделай снимок флуоресценции FDLL. Переключитесь на один из наборов фильтра флуоресценции HPTS на микроскопе, чтобы убедиться, что флуоресценция HTPS хорошо видна и различима от фона. Увеличьте интенсивность света, если это не так.
Программа микроскоп программного обеспечения для выполнения приутупляется изображение приобретения путем чередования двух наборов фильтров HTPS. Для этого установите одну секунду экспозиции, а затем перейдите в приложения меню. Затем определите/запустите приобретение ND и выберите два канала HTPS.
Установите задержку между приобретениями изображений как минимум. В этом эксперименте используйте 0,3-секундную задержку и пятиминутную общую продолжительность. Отрегулируйте настройки potentiostat, чтобы изменить потенциал во время приобретения изображения, как указано в текстовом протоколе.
Теперь одновременно запустите время получения изображения на микроскопе и потенциальную последовательность на potentiostat, вручную начав оба измерения в то же время. Здесь показаны флуоресцентные изображения липосом, поглощаемые электродами при трех различных покрытиях. Краситель, содержащий липосомы, виден на изображениях как яркие пятна.
Центральная часть изображения была отбеленной, чтобы показать уровень фоновых флоресок. Изображения на двух каналах HTPS сверхвыразимы там, где соотношение между двумя каналами соответствует рН 7,4, используемому в этом эксперименте. Большее количество липосом видны с каналом FDLL, что указывает на наличие липосом, которые не инкапсулированы HPTS.
Разница между каналами HPTS и FDLL более выражена при более высоком охвате. Возможно, потому, что при высоком липосоме покрытие, липосомы, скорее всего, лопнет или предохранитель на поверхности. Здесь изменение липосомной флуоресценции на двух каналах HTPS отображается как 3D поверхностный участок соответствующей области в течение 300 секунд эксперимента.
Редуктивный потенциал применялся от 60 секунд до 180 секунд. Показан соответствующий участок соотношения интенсивности метрики объема двух каналов HPTS к времени. Здесь показаны медианы всех изменений pH vesicle в пределах одного изображения, когда содержание цитохрома BO3 составляет 1,3%Увеличение рН хорошо видно, когда потенциал между 0,1 и 0,3 вольт применяется.
Когда содержание цитохрома BO3 значительно ниже значения 0,1%, средние кривые становятся почти неотличимыми от значений пустых липосом. Важно обеспечить полное удаление сурфактанта из липосомных диспенсаций, так как остатки могут увеличить проницаемость липосом протонов. Эти методы позволяют задавать конкретные вопросы о натуральном липофильном субстрате хинона в отличие от часто используемых водорастворимых аналогов хинона.
Более того, эксперименты с одним ферментом выявили ранее неизвестное состояние утечки, в котором белок действует как протонный канал, где протоны свободно текут назад.
