Este método permite el estudio de la actividad de transporte de protones de enzimas de membrana respiratoria como el citocromo BO3 en un ambiente natural de dos capas de lípidos. Las principales ventajas de esta técnica enzimática única es la posibilidad de iniciar y detener las reacciones enzimáticas en cualquier momento utilizando electroquímica. Usando una jeringa de vidrio transfiera 200 microlitros de material de cloroformo de extracto polar lipídico de Escherichia coli en viales de vidrio para hacer alícuotas de cinco miligramos.
Añadir 50 microlitros de un miligramo por mililitro ubiquinona 10 a los lípidos para hacer la proporción final de uno a 100 ubiquinona 10 a lípidos. A la mezcla añadir 20 microlitros de un miligramo por mililitro de longitud de onda larga colorante fluorescente etiquetado FDLL abreviado de lípidos. Homogeneizar la solución de cloroformo mediante vórtice corto y evaporar la mayor parte del cloroformo bajo un suave flujo de nitrógeno o argón.
Retire los rastros de cloroformo por completo por una mayor evaporación al vacío durante al menos una hora. Añadir 312,5 microlitros de 40 MOPS milimétricas pH 7.4 tampón a una alícuota de lípidos ubiquinona 10 FDLL mezcla seca. Mezclar el vórtice hasta que la película de lípidos se suspenda por completo seguido de dos minutos de tratamiento en un baño ultrasónico.
A continuación, agregue 125 microlitros de 25 HPTS mililolares, un tinte fluorescente sensible al pH que se encapsulará dentro de los liposomas. Ahora agregue 137,5 microlitros de 250 surfactantes OGP mili evolucionadores. Después de mezclar usando vórtice, sonicar la mezcla en un baño de agua ultrasónica durante 10 minutos para asegurar que todos los lípidos se solubilizan en micelas surfactantes.
A continuación, transfiera la dispersión a un tubo de plástico de 1,5 mililitros. Añadir la cantidad necesaria de citocromo BO3 y añadir agua ultra pura para hacer un volumen total de 50 microlitros. Incubar la mezcla de reconstitución a cuatro grados centígrados durante 10 minutos en una mezcladora de rodillos.
A continuación, pesa 50 miligramos de microperla de poliestireno en cada una de las dos tapas de tubo de 1,5 mililitros. A continuación, pesar 100 miligramos de microperla de poliestireno en otras dos tapas de tubo de 1,5 mililitros. Cierre las tapas con película de parafina para evitar el secado.
Añadir los primeros 50 miligramos de microperlas de poliestireno en la mezcla de reconstitución poniendo la tapa con microperlas de poliestireno en el tubo de plástico de 1,5 mililitros con la dispersión preparada. A continuación, realice un giro corto durante un par de segundos para llevar las microperlaces a la parte inferior del tubo. Incubar la suspensión a cuatro grados centígrados en una mezcladora de rodillos para permitir que las micropersiones de poliestireno absorban el surfactante durante 30 minutos.
Repita las adiciones de microperdas de poliestireno e incubaciones de la siguiente manera. Añadir 50 miligramos de microperlas durante 60 minutos de incubación. Luego agregue 100 miligramos de microperlas durante 60 minutos de incubación.
Y finalmente, añadir 100 miligramos de microperlas para 120 minutos de incubación. Separe la solución proteoliposoma de los micropers de poliestireno utilizando una micropipeta con una punta delgada. Diluir la dispersión en 90 mililitros de tampón MOPS en el tubo de ultracentrífuga TI 45.
Ultracentrífaza la dispersión utilizando un rotor de tipo 45 TI a 125.000 veces G durante una hora para peletizar los proteoliposomas. Después de la ultracentrifugación, deseche el sobrenadante y enjuague los pellets con tampón MOPS sin resuspendir el pellet. Después de desechar el tampón de enjuague, vuelva a suspender los proteoliposomas en 500 microlitros de tampón MOPS pipegándolo de ida y vuelta con una micropipeta de punta fina antes de transferir la suspensión a un tubo de plástico de 1,5 mililitros.
Después de la centrifugación durante cinco minutos a 12.000 veces G para eliminar los residuos, transfiera el sobrenadante que es los proteoliposomas reconstituidos a un vial nuevo. Pegue hasta nueve resbalones de cubierta de vidrio en una superficie de oro evaporado utilizando epoxi bicomponente de baja fluorescencia. Curar el pegamento a 80 grados centígrados durante cuatro horas.
Justo antes de la modificación con una monocapa autoensamblada, desenganche los resbalones de la cubierta de vidrio de las obleas de silicona con una cuchilla. Debido a la delgadez de los resbalones de la cubierta, tenga cuidado al desmontar los resbalones de la cubierta para no agrietar o romper los portaobjetos de vidrio. Sumerja la cubierta recién desprendida recubierta de oro en una solución de 6-marcaptohexanol y deje a 20 a 25 grados centígrados durante la noche para formar la monocapa automontada.
Al día siguiente, retire los resbalones de la cubierta recubierta de oro de la solución y lave brevemente con agua o metanol y luego con isopropanol. Seque la cubierta recubierta de oro se desliza bajo un suave flujo de gas. Montar el resbalón de cubierta recubierto de oro en una célula espectro-electroquímica como se diagrama en el protocolo de texto.
Haga contacto con el oro con un alambre plano fuera de un área definida por una junta tórica de goma y atornille firmemente la célula electroquímica en la parte superior de la misma. Agregue dos mililitros de la solución tampón de electrolitos y coloque los electrodos de referencia y auxiliares en la célula. Proceda a comprobar la calidad de la monocapa automontada y ejecute espacios en blanco como se describe en el protocolo de texto.
Añadir proteoliposomas a la célula electroquímica a 0,5 miligramos por mililitro de concentración final de lípidos y mezclar ligeramente con una pipeta. Espere de 30 a 60 minutos a temperatura ambiente hasta que termine la absorción de proteoliposomas en la superficie del electrodo. Lave la célula cambiando la solución tampón al menos 10 veces, pero evite dejar la superficie del electrodo completamente seca.
Ahora, ejecute la espectroscopia de impedancia electroquímica en el potencial de celda abierta para confirmar que la monocapa autoensamblada en el electrodo de oro permanece sin cambios. Ejecute voltammogramas cíclicos con velocidades de exploración de 10 y 100 milivoltios por segundo para observar la oxidación catalatica de ubiquinol y la reducción de oxígeno por citocromo BO3 en los potenciales de inicio de la reducción de quinona electroquímica. Modifique el electrodo de oro como antes pero utilizando cinco microgramos por mililitro proteoliposomas.
Para estudios enzimáticos individuales, reducir la relación citocromo BO3 a lípidos a entre 0,1 y 0,2%Coloque una gota de aceite de inmersión y luego la célula electroquímica en el objetivo de aceite 60 veces de un microscopio de fluorescencia invertido. Usando filtros apropiados para la fluorescencia FDLL, concéntrese en la superficie del electrodo. Los liposomas individuales deben aparecer como puntos brillantes en el límite de difracción del objetivo del microscopio.
Tome una imagen de FDLL florescence. Cambie a uno de los conjuntos de filtros de florescencia HPTS en el microscopio para verificar que la florescencia de HTPS es claramente visible y distinguible del fondo. Aumente la intensidad de la luz si no es el caso.
Programe el software del microscopio para realizar una adquisición de imágenes cronopcionada alternando dos conjuntos de filtros HTPS. Para ello, establezca una exposición de un segundo y, a continuación, vaya a las aplicaciones de menú. A continuación, defina/ejecute ND Acquisition y seleccione dos canales HTPS.
Establezca el retardo entre las adquisiciones de imágenes como mínimo. En este experimento utilice un retraso de 0,3 segundos y una duración total de cinco minutos. Ajuste la configuración del potenciostato para cambiar el potencial durante la adquisición de la imagen como se indica en el protocolo de texto.
Ahora, ejecute simultáneamente la adquisición de imágenes cronometen en el microscopio y la secuencia potencial en el potenciostato iniciando manualmente ambas mediciones al mismo tiempo. Aquí se muestran imágenes de fluorescencia de liposomas absorbidos en los electrodos en tres coberturas diferentes. El tinte que contiene liposomas es visible en las imágenes como puntos brillantes.
La parte central de la imagen fue blanqueada con foto para revelar el nivel de florescencia de fondo. Las imágenes en dos canales HTPS son súper imposiblesables donde la relación entre los dos canales corresponde a un pH de 7.4 utilizado en este experimento. Un mayor número de liposomas son visibles con el canal FDLL, lo que indica la presencia de liposomas que no tienen HPTS encapsulado.
La diferencia entre los canales HPTS y FDLL es más pronunciada en coberturas más altas. Posiblemente porque con una cobertura de liposomas alta, los liposomas son más propensos a estallar o fusionarse en la superficie. Aquí, el cambio de una florescencia liposoma en dos canales HTPS se muestra como una gráfica de superficie 3D del área correspondiente durante 300 segundos del experimento.
El potencial reductivo se aplicó entre 60 segundos y 180 segundos. Se muestra la gráfica correspondiente de la relación de intensidad métrica de volumen de dos canales HPTS frente al tiempo. Aquí se muestran las medianas de todos los cambios de pH de la vesícula dentro de una sola imagen cuando el contenido de citocromo BO3 es 1.3%Un aumento en el pH es claramente visible cuando se aplica un potencial entre 0.1 y 0.3 voltios.
Cuando el contenido de citocromo BO3 es un valor mucho menor de 0.1%, las curvas medianas se vuelven casi indistinguibles de las de los liposomas vacíos. Es importante asegurar la eliminación completa del surfactante de las dispensaciones liposomas ya que los residuos pueden aumentar la permeabilidad de los liposomas a los protones. Estos métodos nos permiten hacer preguntas específicas sobre el sustrato natural de quinona lipofílica en contraste con los análogos de quinona soluble en agua a menudo utilizados.
Además, los experimentos de una sola enzima identificaron un estado de fuga previamente desconocido donde la proteína actúa como un canal de protones donde los protones fluyen libremente hacia atrás.
