Este método permite o estudo da atividade de transporte de prótons de enzimas de membrana respiratória como o citocromo BO3 em um ambiente de camadas bi-camadas lipídicas naturais. As principais vantagens desta única técnica enzimática é a possibilidade de iniciar e parar reações enzimáticas a qualquer momento usando eletroquímica. Usando uma seringa de vidro transferir 200 microliters de estoque de clorofórmio de extrato polar lipídico de Escherichia coli em frascos de vidro para fazer cinco alíquotas miligramas.
Adicione 50 microliters de um miligrama por mililitro ubiquinona 10 aos lipídios para fazer a proporção final de um a 100 ubiquinona 10 para lipídios. À mistura adicione 20 microliters de um miligrama por mililitro de comprimento de onda longa corante fluorescente rotulado lipídio abreviado FDLL. Homogeneize a solução de clorofórmio por vórtice curto e evaporar a maior parte do clorofórmio sob um suave fluxo de nitrogênio ou argônio.
Remova os traços de clorofórmio inteiramente por evaporação adicional sob vácuo por pelo menos uma hora. Adicione 312,5 microliters de 40 mililitros de pH pH 7.4 a uma alíquota de lipídios ubiquinona 10 FDLL mistura seca. Misture o vórtice até que o filme lipíduo seja totalmente re-suspenso seguido de dois minutos de tratamento em um banho ultrassônico.
Em seguida, adicione 125 microliters de 25 milimolares HPTS, um corante fluorescente sensível ao pH que será encapsulado dentro dos lipossomos. Agora adicione 137,5 microliters de 250 milimões de surfactante OGP. Depois de misturar usando vórtice, sonicize a mistura em um banho de água ultrassônica por 10 minutos para garantir que todos os lipídios sejam solubilizados em micelas surfactantes.
Em seguida, transfira a dispersão para um tubo plástico de 1,5 mililitro. Adicione a quantidade necessária de cytocromo BO3 e adicione água ultra pura para fazer um volume total de 50 microliters. Incubar a mistura de reconstituição a quatro graus celsius por 10 minutos em uma batedeira.
Em seguida, pesam 50 miligramas de microesferas de poliestireno em cada uma das duas tampas de tubo de 1,5 mililitro. Em seguida, pese 100 miligramas de microesferas de poliestireno em outras duas tampas de tubo de 1,5 mililitro. Feche as tampas com filme de parafina para evitar a secagem.
Adicione os primeiros 50 miligramas de microesferas de poliestireno na mistura de reconstituição colocando a tampa com microesferas de poliestireno no tubo plástico de 1,5 mililitro com a dispersão preparada. Em seguida, faça um giro curto por alguns segundos para trazer microesferas para o fundo do tubo. Incubar a suspensão a quatro graus celsius em uma batedeira para permitir que as microesferas de poliestireno absorvam o surfactante por 30 minutos.
Repita as adições de microesferas de poliestireno e incubações da seguinte forma. Adicione 50 miligramas de microesferas por 60 minutos de incubação. Em seguida, adicione 100 miligramas de microesferas por 60 minutos de incubação.
E, finalmente, adicione 100 miligramas de microesferas por 120 minutos de incubação. Separe a solução proteoliposome das microesferas de poliestireno usando uma micropipette com uma ponta fina. Diluir a dispersão em 90 mililitros de tampão MOPS no tubo ultracentrifuuge TI 45.
Ultracentrize a dispersão usando um rotor TI tipo 45 a 125.000 vezes G durante uma hora para pellet os proteoliposomes. Após a ultracentrização, descarte o supernascimento e enxágue as pelotas com tampão MOPS sem reutilizar a pelota. Depois de descartar o tampão de lavagem, suspenda os proteoliposomes em 500 microliters de tampão MOPS, pipetando-o para frente e para trás com uma micropipette fina antes de transferir a suspensão para um tubo plástico de 1,5 mililitro.
Após a centrifugação por cinco minutos a 12.000 vezes G para remover os detritos, transfira o supernatante que é o proteoliposomes reconstituído em um novo frasco. Cole até nove deslizamentos de tampa de vidro em uma superfície de ouro evaporada usando epóxi de baixa fluorescência bi-componente. Cure a cola a 80 graus celsius por quatro horas.
Pouco antes da modificação com uma mono camada auto-montada, desprender a tampa de vidro desliza dos wafers de silicone com uma lâmina. Devido à magreza dos deslizamentos de cobertura, tome cuidado ao desprender os deslizamentos de cobertura para não quebrar ou quebrar os slides de vidro. Mergulhe a tampa recém-destacada revestida de ouro em uma solução de 6 marcasptohexanol e deixe a 20 a 25 graus celsius durante a noite para formar a auto-camada.
No dia seguinte, remova os deslizamentos revestidos de ouro da solução e lave brevemente com água ou metanol e, em seguida, com isopropanol. Seque os deslizamentos revestidos de ouro sob um fluxo suave de gás. Monte o deslizamento de cobertura revestido de ouro em uma célula espectro-eletroquímica como diagramado no protocolo de texto.
Faça contato com o ouro com um fio plano fora de uma área definida por um anel O de borracha e aparafusar firmemente a célula eletroquímica em cima dele. Adicione dois mililitros da solução tampão de eletrólitos e coloque os eletrodos de referência e auxiliares na célula. Proceda para verificar a qualidade da mono camada auto-montada e executar espaços em branco conforme descrito no protocolo de texto.
Adicione proteoliposomes à célula eletroquímica a 0,5 miligramas por concentração de lipídios finais mililitros e misture ligeiramente com uma pipeta. Aguarde de 30 a 60 minutos em temperatura ambiente até que a absorção de proteolipóss na superfície do eletrodo esteja concluída. Lave a célula alterando a solução tampão pelo menos 10 vezes, mas evite deixar a superfície do eletrodo completamente seca.
Agora, execute espectroscopia eletroquímica de impedância em potencial de célula aberta para confirmar que a mono-camada auto-montada no eletrodo de ouro permanece inalterada. Execute os ciclogramas cíclicos com taxas de varredura 10 e 100 milvolts por segundo para observar a oxidação catalítica de ubiquinol e a redução de oxigênio por cytocromo BO3 em potencial de início de redução eletroquímica da quinone. Modifique o eletrodo de ouro como antes, mas usando cinco microgramas por proteoliposomes mililitros.
Para estudos de enzima única reduza a relação citocromo BO3 para lipídio entre 0,1 e 0,2% Coloque uma gota de óleo de imersão e, em seguida, a célula eletroquímica no objetivo 60 vezes do óleo de um microscópio de fluorescência invertida. Utilizando filtros apropriados para fluorescência FDLL, concentre-se na superfície do eletrodo. Lipossomos únicos devem aparecer como pontos brilhantes no limite de difração do objetivo do microscópio.
Tire uma imagem da florescência da FDLL. Mude para um dos conjuntos de filtros de floresnce do HPTS no microscópio para verificar se a florescence HTPS é claramente visível e distinguível a partir do fundo. Aumente a intensidade da luz se não for o caso.
Programe o software de microscópio para realizar uma aquisição de imagem cronometrado alternando dois conjuntos de filtros HTPS. Para isso, defina uma exposição de um segundo e navegue para aplicativos de menu. Em seguida, defina/execute a aquisição do ND e selecione dois canais HTPS.
Defina o atraso entre as aquisições de imagens no mínimo. Neste experimento use 0,3 segundo de atraso e duração total de cinco minutos. Ajuste as configurações do potencialiostat para alterar o potencial durante a aquisição da imagem, conforme indicado no protocolo de texto.
Agora, execute simultaneamente a aquisição de imagem cronometrado no microscópio e a sequência potencial no potencialiostat, iniciando manualmente ambas as medições ao mesmo tempo. Aqui são mostradas imagens de fluorescência de lipossomos absorvidos nos eletrodos em três coberturas diferentes. O corante contendo lipossomos são visíveis nas imagens como pontos brilhantes.
A parte central da imagem foi foto-branqueada para revelar o nível de floresnce de fundo. As imagens em dois canais HTPS são super imposiveis onde a razão entre os dois canais corresponde a um pH de 7,4 usado neste experimento. Um número maior de lipossomos são visíveis com o canal FDLL, o que indica a presença de lipossomos que não têm HPTS encapsulados.
A diferença entre os canais HPTS e FDLL é mais acentuada em coberturas mais altas. Possivelmente porque em alta cobertura liposso, lipossomos são mais propensos a estourar ou fundir na superfície. Aqui, a mudança de um florescência lipossa em dois canais HTPS é mostrada como um gráfico de superfície 3D da área correspondente durante 300 segundos do experimento.
O potencial redutivo foi aplicado entre 60 segundos e 180 segundos. A proporção correspondente da razão de intensidade métrica de volume de dois canais HPTS versus tempo é mostrada. Aqui estão as medianas de todas as alterações de pH vesícula dentro de uma única imagem quando o teor de CYtocromo BO3 é de 1,3% Um aumento no pH é claramente visível quando um potencial entre 0,1 e 0,3 volts é aplicado.
Quando o teor de CYtocromo BO3 é um valor muito menor de 0,1% as curvas medianas tornam-se quase indistinguíveis das de lipossomos vazios. É importante garantir a remoção completa do surfactante das dispensas lipossas, uma vez que os resíduos podem aumentar a permeabilidade dos lipossos aos prótons. Esses métodos permitem-nos fazer perguntas específicas sobre o substrato de quinona lipofílico natural em contraste com os análogos de quinone solúveis em água frequentemente usados.
Além disso, os experimentos de enzimas identificaram um estado de vazamento até então desconhecido onde a proteína age como um canal de prótons onde prótons fluem livremente para trás.
