Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Protonentransportaktivität von Atmungsmembranenzymen wie Cytochrom BO3 in einer natürlichen Lipid-Zweischichtumgebung. Der Hauptvorteil dieser Einzelenzymtechnik ist die Möglichkeit, enzymatische Reaktionen jederzeit mit Hilfe der Elektrochemie zu beginnen und zu stoppen. Mit einer Glasspritze transferieren Sie 200 Mikroliter Chloroform-Lager aus Lipidpolarextrakt aus Escherichia coli in Glasfläschchen, um fünf Milligramm Aliquots zu machen.
Fügen Sie 50 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter Ubiquinon 10 zu den Lipiden, um das endgültige Verhältnis von eins zu 100 Ubichinon 10 zu Lipiden zu machen. Zur Mischung fügen Sie 20 Mikroliter von einem Milligramm pro Milliliter lange Wellenlänge Fluoreszenzfarbstoff mit der Bezeichnung Lipid abgekürzt FDLL. Homogenisieren Sie die Chloroform-Lösung durch kurzes Wirbeln und verdampfen Sie den größten Teil der Chloroform unter einem schonenden Stickstoff- oder Argonfluss.
Entfernen Sie die Chloroformspuren durch weitere Verdunstung unter Vakuum für mindestens eine Stunde vollständig. Fügen Sie 312,5 Mikroliter 40 Millimolar MOPS pH 7.4 Puffer zu einem Aliquot von Lipiden Ubiquinon 10 FDLL Trockenmischung. Mischen Sie den Wirbel, bis der Lipidfilm vollständig wieder aufgehängt wird, gefolgt von zwei Minuten Behandlung in einem Ultraschallbad.
Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter von 25 Millimolar HPTS hinzu, einem pH-empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff, der in den Liposomen eingekapselt wird. Fügen Sie nun 137,5 Mikroliter 250 Millimolar OGP Tensid hinzu. Nach dem Mischen mit Wirbel, beschallen Sie die Mischung in einem Ultraschall-Wasserbad für 10 Minuten, um sicherzustellen, dass alle Lipide in Tensid-Mizellen löslich sind.
Dann die Dispersion in ein 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr geben. Fügen Sie die erforderliche Menge an Cytochrom BO3 hinzu und fügen Sie ultrareines Wasser hinzu, um ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern zu machen. Die Rekonstitutionsmischung bei vier Grad Celsius 10 Minuten lang auf einem Walzenmischer inkubieren.
Als nächstes wiegen 50 Milligramm Polystyrol Mikroperlen in jeder der beiden 1,5 Milliliter Rohrkappen. Dann wiegen 100 Milligramm Polystyrol Mikroperlen in zwei weitere 1,5 Milliliter Rohrkappen. Schließen Sie die Kappen mit Paraffinfolie, um ein Trocknen zu verhindern.
Fügen Sie die ersten 50 Milligramm Polystyrol-Mikroperlen in die Rekonstitutionsmischung ein, indem Sie die Kappe mit Polystyrol-Mikroperlen auf das 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr mit der vorbereiteten Dispersion legen. Führen Sie dann einen kurzen Spin für ein paar Sekunden durch, um Mikroperlen an den Boden des Rohres zu bringen. Inkubieren Sie die Suspension bei vier Grad Celsius auf einem Walzenmischer, damit die Polystyrol-Mikroperlen das Tensid 30 Minuten lang aufnehmen können.
Wiederholen Sie die Zusätze von Polystyrol-Mikroperlen und Inkubationen wie folgt. Fügen Sie 50 Milligramm Mikroperlen für 60 Minuten Inkubation. Dann fügen Sie 100 Milligramm Mikroperlen für 60 Minuten inkubation.
Und schließlich, fügen Sie 100 Milligramm Mikroperlen für 120 Minuten inkubation. Trennen Sie die Proteoliposomlösung von den Polystyrol-Mikroperlen mit einer Mikropipette mit einer dünnen Spitze. Verdünnen Sie die Dispersion in 90 Milliliter MOPS-Puffer in TI 45 Ultrazentrifugenrohr.
Ultrazentrifugieren Sie die Dispersion mit einem Typ 45 TI Rotor bei 125. 000 mal G für eine Stunde, um die Proteoliposomen zu pellet. Nach der Ultrazentrifugation den Überstand entsorgen und die Pellets mit MOPS-Puffer ausspülen, ohne das Pellet wieder aufzuhängen. Nachdem Sie den Spülpuffer verworfen haben, setzen Sie die Proteoliposomen in 500 Mikroliter MOPS-Puffer wieder auf, indem Sie ihn mit einer dünnen mikropipette hin und her pfeifen, bevor Sie die Suspension in ein 1,5-Milliliter-Kunststoffrohr übertragen.
Nach zentrifugieren für fünf Minuten bei 12.000 mal G, um die Trümmer zu entfernen, übertragen Sie den Überstand, der die rekonstituierten Proteoliposomen ist, in eine neue Durchstechflasche. Mit zweikomponenten fluoreszierendem Epoxid werden bis zu neun Glasabdeckungen auf eine verdampfte Goldoberfläche geklebt. Den Kleber vier Stunden lang bei 80 Grad Celsius aushärten.
Kurz vor der Modifikation mit einer selbstmontierten Monoschicht die Glasabdeckung von den Silikonwafern mit einer Klinge lösen. Aufgrund der Dünnen der Abdeckung rutscht, achten Sie beim Lösen der Abdeckung rutscht nicht zu knacken oder brechen die Glasrutschen. Tauchen Sie die frisch abgetrennte goldbeschichtete Abdeckung schlüpft in eine 6-Marcaptohexanol-Lösung und lassen Sie bei 20 bis 25 Grad Celsius über Nacht die selbst montierte Mono-Schicht bilden.
Am nächsten Tag die vergoldeten Deckelschlupf von der Lösung nehmen und kurz mit Wasser oder Methanol und dann mit Isopropanol waschen. Trocknen Sie die vergoldete Abdeckung rutscht unter einem sanften Gasstrom. Montieren Sie den goldbeschichteten Deckelschlupf in einer spektro-elektrochemischen Zelle, wie im Textprotokoll dargestellt.
Nehmen Sie kontaktiere das Gold mit einem flachen Draht außerhalb eines durch einen Gummi-O-Ring definierten Bereichs und schrauben Sie die elektrochemische Zelle darauf fest. Fügen Sie zwei Milliliter der Elektrolytpufferlösung hinzu und legen Sie die Referenz- und Hilfselektroden in die Zelle. Überprüfen Sie die Qualität der selbst zusammengesetzten Mono-Layer, und führen Sie Leerzeichen aus, wie im Textprotokoll beschrieben.
Proteoliposomen bei 0,5 Milligramm pro Milliliter Endfettkonzentration in die elektrochemische Zelle geben und leicht mit einer Pipette vermischen. Warten Sie 30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur, bis die Absorption von Proteoliposomen auf der Elektrodenoberfläche abgeschlossen ist. Waschen Sie die Zelle, indem Sie die Pufferlösung mindestens 10 Mal wechseln, aber vermeiden Sie, die Elektrodenoberfläche vollständig trocken zu lassen.
Führen Sie nun die elektrochemische Impedanzspektroskopie an offenem Zellpotenzial aus, um die selbstzusammengesetzte Monoschicht auf der Goldelektrode zu bestätigen, unverändert. Führen Sie zyklische Voltammogramme mit Scanraten von 10 und 100 Millivolt pro Sekunde aus, um die katalatische Ubiquinoloxidation und Sauerstoffreduktion durch Cytochrom BO3 bei Beginn der elektrochemischen Chinonreduktion zu beobachten. Ändern Sie die Goldelektrode wie zuvor, aber mit fünf Mikrogramm pro Milliliter Proteoliposomen.
Reduzieren Sie bei Einzelenzymstudien das Cytochrom-BO3-Lipid-Verhältnis auf 0,1 bis 0,2%Platzieren Sie einen Tropfen Tauchöl und dann die elektrochemische Zelle auf das 60-fache Ölobjektiv eines invertierten Fluoreszenzmikroskops. Mit geeigneten Filtern für die FDLL-Fluoreszenz konzentrieren Sie sich auf die Elektrodenoberfläche. Einzelne Liposomen sollten als helle Flecken an der Beugungsgrenze des Mikroskopobjektivs erscheinen.
Nehmen Sie ein Bild von FDLL Blütenstand. Wechseln Sie zu einem der HPTS-Blütenfiltersätze am Mikroskop, um zu überprüfen, ob HTPS-Blütenstand deutlich sichtbar und vom Hintergrund zu unterscheiden ist. Erhöhen Sie die Lichtintensität, wenn dies nicht der Fall ist.
Programmieren Sie die Mikroskopsoftware, um eine zeitgezeitieinige Bildaufnahme durchzuführen, indem Sie zwei HTPS-Filtersätze wechseln. Legen Sie dazu eine Belichtungszeit von einer Sekunde fest und navigieren Sie dann zu Menüanwendungen. Definieren/Ausführen der ND-Erfassung und wählen Sie zwei HTPS-Kanäle aus.
Legen Sie die Verzögerung zwischen den Bildabsicherungen mindestens fest. Verwenden Sie in diesem Experiment 0,3 Sekunden Verzögerung und eine Gesamtdauer von fünf Minuten. Passen Sie die Einstellungen des Potentiostats an, um das Potenzial während der Bildaufnahme zu ändern, wie im Textprotokoll angegeben.
Führen Sie nun gleichzeitig die zeitgenaue Bildaufnahme auf dem Mikroskop und die potenzielle Sequenz auf dem Potentiostat aus, indem Sie beide Messungen gleichzeitig manuell starten. Hier sind Fluoreszenzbilder von Liposomen zu sehen, die bei drei verschiedenen Abdeckungen auf die Elektroden absorbiert werden. Der Farbstoff, der Liposomen enthält, ist auf den Bildern als helle Flecken sichtbar.
Der zentrale Teil des Bildes wurde fotogebleicht, um die Hintergrundblütenzuflaute zu enthüllen. Die Bilder auf zwei HTPS-Kanälen sind super unverstwirslich, wenn das Verhältnis zwischen den beiden Kanälen einem in diesem Experiment verwendeten pH-Wert von 7,4 entspricht. Eine größere Anzahl von Liposomen sind mit dem FDLL-Kanal sichtbar, was auf das Vorhandensein von Liposomen hinweist, die keine HPTS-verkapselt haben.
Der Unterschied zwischen den HPTS- und FDLL-Kanälen ist bei höheren Abdeckungen stärker ausgeprägt. Möglicherweise, weil bei hoher Liposomenabdeckung, Liposomen sind eher platzen oder Sicherung auf der Oberfläche. Hierwird wird die Veränderung einer Liposomenblüten auf zwei HTPS-Kanälen als 3D-Oberflächendiagramm des entsprechenden Bereichs während 300 Sekunden des Experiments dargestellt.
Das reduktive Potenzial wurde zwischen 60 Sekunden und 180 Sekunden angewendet. Das entsprechende Diagramm des Volumenmetrikintensitätsverhältnisses von zwei HPTS-Kanälen im Vergleich zur Zeit wird angezeigt. Hier sind die Mediane aller vesikeligen pH-Änderungen innerhalb eines einzelnen Bildes dargestellt, wenn der Cytochrom-BO3-Gehalt 1,3% beträgt.
Wenn Cytochrom-BO3-Gehalt einen viel niedrigeren Wert von 0,1% hat, werden die Mediankurven fast nicht mehr von denen leerer Liposomen zu unterscheiden. Es ist wichtig, eine vollständige Entfernung des Tensids aus den Liposomendispensationen sicherzustellen, da die Residuen die Durchlässigkeit der Liposomen gegenüber Protonen erhöhen können. Diese Methoden ermöglichen es uns, spezifische Fragen zum natürlichen lipophilen Chinonsubstrat im Gegensatz zu den oft verwendeten wasserlöslichen Chinonanaloga zu stellen.
Darüber hinaus identifizierten die Einzelenzymexperimente einen bisher unbekannten Leckzustand, in dem das Protein als Protonenkanal fungiert, in dem Protonen frei rückwärts fließen.
