此方法有助于使用不需要专用设备的简单、廉价的方法比较不同细胞类型的细胞毒性活性。这种技术的主要优点是，它不需要使用危险材料，它便宜，也不需要使用专门的设备。此方法可用于测量其他细胞类型的细胞毒性活性，如CD8加细胞解细胞，甚至评估细胞的自发死亡，没有孵化，没有细胞解效应细胞。
对这项技术的新鲜人可能会难以与目标到效应细胞比的优化。我的建议是对文献进行彻底搜索，以确定在优化协议时要测试的比率。虽然这种方法不需要专门技能，但除了准确移液，单核细胞的分离和检测板的设置是更容易理解和模仿的步骤，如果他们在视觉上观察。
展示这个程序的将是切尔西·杰凯利，一个来自我实验室的技术员。要开始此过程，在 1.5 毫升 FBS 中加入 13.5 毫升 RPMI，加入含有 100 微米过滤器的培养皿中。将一个胎盘放在过滤器上，并使用注射器柱塞的平侧推过过滤器并放入培养皿中。
接下来，为每个组织设置三个 15 毫升锥形管。向每个管添加三毫升密度梯度介质，并缓慢地将五毫升均质胎盘覆盖到每个管中。在300倍G下离心，在室温下离心25分钟，不休息。
然后，使用转移移液器收集薄的白色布菲层。将 10 毫升 RPMI 添加到组合的布菲层中。在300倍G和4摄氏度下离心10分钟，然后丢弃上一代。
首先，将细胞颗粒重新悬浮在50微升的冰冷PBS中。根据制造商的协议添加生物素标记的CD3抗体，并很好地与移液器混合。将管子放入管旋转器中，在4摄氏度下孵育20分钟。
接下来，添加一毫升的 RPMI。在400倍G和4摄氏度的离心机10分钟。丢弃上一杯，将颗粒重新悬浮在一毫升的 RPMI 中。
将细胞悬浮液与 1.5 毫升微离心管中的 150 微升磁珠混合。将管子转移到管旋转器上，并在4摄氏度下孵育30分钟。在孵育过程中，取回释放缓冲液，让它在生物安全柜中达到室温。
孵育完成后，将管子放在磁铁中一分钟。收集上一提液，将CD3负细胞量保存在15毫升的冰上管中。从磁铁上取下管子，加入一毫升的RPMI，并使用移液器将细胞和珠子混合五次。
然后，将管子放回磁铁中一分钟。收集上一杯，将CD3负量保存在15毫升的冰上管中。将CD3负细胞在400倍G和4摄氏度下离心10分钟。
丢弃上清液，将细胞颗粒重新悬浮在50微升的冰冷PBS中。在此之后，根据制造商的说明，在CD3阴性细胞中加入生物素标记的CD161A抗体，并混合好。将管子放在管旋转器中，在4摄氏度下孵育20分钟。
接下来，在400倍G和4摄氏度下加入1毫升RPMI和离心机10分钟。丢弃上流剂，将颗粒重新悬浮在一毫升的 RPMI 中，并在 1.5 毫升微离心管中将其与磁珠结合。将管子放在管旋转器中，在4摄氏度下孵育30分钟。
然后，将管子放在磁铁中一分钟。收集上一液并丢弃CD3负CD161A阴性细胞。从磁铁上取下管子，加入一毫升RPMI并混合好。
将管子放在磁铁中一分钟，确保收集上一液并丢弃CD3负CD161A阴性细胞。在此之后，从磁铁上取出管子，并加入一毫升室温释放缓冲液。将管子放在管子旋转器上，并在室温下孵育15分钟时旋转。
接下来，将管子放在磁铁中一分钟。将上流水线收集在冰上一个新的15毫升锥形管中。从磁铁上取下管子，加入一毫升室温RPMI，混合好。
将管子放回磁铁下一分钟，确保在同一15毫升锥形管中收集上流水液。混合好，采取20微升样本计数细胞。在400倍G和4摄氏度下将细胞离心10分钟。
取出上一液，重新挂起 RPMI 中的细胞。将细胞以每孔30万个细胞的浓度在2.5毫升NK细胞活化介质中播种到六井板中。在37摄氏度下用5%的二氧化碳在加湿的孵化器中孵育48小时。
在发动机罩中，使用血清移液器将介质中的 YAC1 细胞转移到冰上 50 毫升管中，并很好地混合。拿20微升等分来数细胞。在300倍G和4摄氏度下旋转细胞10分钟。
使用血清移液器，从先前准备的 NK 细胞六井板收集上流液，在 15 毫升锥形管中。然后，将 trypsin EDTA 添加到每个井中。轻点盘子，在摄氏37度的培养箱中放置。
细胞用尝试性EDTA孵育约5分钟后，使用无菌板刮刀刮板。然后向每个孔添加一毫升NK细胞介质。使用血清移液器，收集细胞和介质，并将它们转移到15毫升的离心管中。
拿20微升等分来数细胞。将NK细胞在400倍G和4摄氏度下离心10分钟。首先，获得一个圆的底部，培养处理96井板，并设置它如表之一的文本协议概述。
将检测板以250倍G离心4分钟，确保效应器与目标细胞接触。接下来，在37摄氏度的加湿室中孵育板，用5%的二氧化碳孵育5小时。在收获超钠前45分钟，将10微升10X解液加入目标细胞最大LDH释放井，并将板返回加湿室。
孵育完成后，将板在250倍G下离心4分钟，然后使用多通道管道将50微升等分液从每一个井转移到一个新的96井、平底检测板。在检测板的每个井中加入50微升的测定试剂。用铝箔盖住盘子，防止其光线，并在室温下孵育30分钟。
在此之后，向每个井添加 50 微升停止解决方案。确保在添加停止溶液后一小时内读取板，并在 490 纳米时记录吸光度。从NP和RUPP大鼠获得的胎盘NK细胞在各自的基体中以50：1的比例孵育5小时。
此处显示了 490 纳米记录的原始吸收数据。计算了文化介质背景和体积校正控制井的平均吸光度，并从制造商协议中指示的适当井中减去这些平均值。然后使用制造商提供的协议获取细胞毒性校正值。
虽然这种方法不需要专门技能，但除了准确移液，单核细胞的分离和检测板的设置是更容易理解和模仿的步骤，如果他们在视觉上观察。在NK细胞分离后，可以执行许多其他程序，如联合培养实验，以确定胎盘NK细胞在怀孕期间归因于成骨细胞迁移的作用。我们还从扩大的NK细胞中收集介质，以评估从分差刺激细胞分泌的细胞激酶。
分离细胞的纯度也可以通过流式细胞测量进行评估。
