通过纵向荧光显微镜监测新生儿生存

该协议使研究人员能够监测单细胞的存活率，并确定显著预测细胞死亡或存活的变量。传统的细胞毒性测定评估细胞群，缺乏区分单个细胞的能力。纵向显微镜允许为种群中每个细胞分配死亡时间。

该技术非常适合评估神经退行性疾病和其他疾病的新疗法。这种方法已被证明对探索神经退行性疾病中的疾病机制无价，并可以同样有效地应用于其他细胞死亡感兴趣的疾病。研究人员可能难以达到足够的转染效率，而不会产生不适当的毒性。

使用多通道移液器并熟悉协议，随着时间的推移应减少这些困难。显微镜是一种固有的视觉方法。因此，除了阅读之外，通过观看可能更容易理解这种技术。

首先，将适当数量的减少血清介质和转染试剂组合在一个管中，并在单独的管中减少血清介质和DNA。在室温下孵育五分钟。然后，将两管的内装物混合，在室温下孵育20分钟。

使用多通道移液器和消毒塑料槽两次洗皮质神经元，每井用100微升神经基底介质清洗。将有条件介质和其他剩余介质储存在 37 摄氏度。每井更换 100 微升以前准备的 NBKY 溶液的 NBM。

20分钟后，移液50微升的转染试剂和DNA混合物滴入每个井。在37摄氏度下孵育细胞20分钟。使用 NBKY 溶液冲洗细胞两次。

然后添加100微升的有条件介质和100微升的NBC解决方案到井。要开始对细胞进行成像，请将96井板放在荧光显微镜上。使用每个板唯一的受托标记作为未来对齐的参考，并保存图像供将来参考。

然后，导航到感兴趣区域并记录相对于标记的 x 和 y 坐标。使用每个板唯一的受托标记作为未来对齐的参考，并保存图像供将来参考。最后，关注表达荧光标签的转染细胞。

在适当的荧光通道中以定期间隔拍摄多个图像。要从图像处理开始，请双击斐济图标。然后，单击图像下划线处理宏到斐济栏上以打开斐济内的宏。

根据文本协议调整图像下划线处理宏的 2 行到 7 行。然后，单击拼接，然后网格/集合拼接。调整下拉菜单、类型和顺序中的设置，直到生成精确拼接的图像。

根据这些选择调整网格类型和在第 8 行和第 9 行中缝合顺序变量。然后，调整第 10 行以指定每井的图像数，如有必要，将第 14 行的背景减法选项设置为 true。调整第 15 行以根据文本协议设置滚动球半径，然后单击"运行"。

最后，打开输出图像堆栈，根据文本协议手动识别死神经元。将数据记录在电子表格文件中。要执行统计分析，请双击图标以求生存。

R 脚本。突出显示第二行并单击运行按钮以加载生存库。然后，更改第 5 行中的路径以调用输入电子表格，然后单击运行按钮。

突出显示第 8 行和第 9 行，然后单击运行按钮以执行 Cox 比例危险分析。突出显示第 12 行到 16 行和 19 行到 24 行。单击运行按钮，将累积死亡风险和生存数据绘制为卡普兰-迈尔曲线。

在这项研究中，大鼠皮质神经元在电镀后四天内被转染，质粒编码为荧光蛋白M苹果。转染后24小时，神经元连续10天每24小时用荧光显微镜成像。在图像采集后，图像得到处理，并按顺序检查，以标记细胞死亡。

每个细胞的死亡时间由细胞体荧光、形态和碎片的变化决定。对突变神经元的生存数据进行考克斯比例危害分析，导致危险比为2.2。这一结果表明，与野生型种群相比，突变神经元的死亡率更快。

尝试此过程时，要记住的最重要的事情是小心移液。最大限度地减少空气暴露和避免气泡对于成功转染至关重要。转染后，除了细胞存活率外，纵向荧光显微镜还可用于跟踪可能导致细胞死亡的各种因素，包括蛋白质定位、周转和表达水平。

在神经退化领域，纵向显微镜的动态性质揭示了疾病相关蛋白质的聚集是否代表有毒或保护性事件。这些试剂或仪器均无危险。