Ce protocole permet aux chercheurs de surveiller la survie à une seule cellule et d’identifier les variables qui prédisent de façon significative la mort ou la survie des cellules. Les analyses conventionnelles de cytotoxicité évaluent les populations de cellules et n’ont pas la capacité de discriminer les cellules individuelles. La microscopie longitudinale permet l’attribution de l’heure du décès pour chaque cellule d’une population.
Cette technique est bien adaptée pour évaluer de nouvelles thérapies pour les maladies neurodégénératives et d’autres conditions. Cette méthode s’est avérée inestimable pour explorer les mécanismes de la maladie dans les conditions neurodégénératives, et pourrait être appliquée avec une efficacité égale à d’autres troubles dans lesquels la mort cellulaire est d’intérêt. Les chercheurs peuvent avoir du mal à réaliser des gains d’efficacité adéquats en matière de transfection sans toxicité indue.
La pratique avec le pipet multicanal et la familiarité avec le protocole devraient diminuer ces difficultés au fil du temps. La microscopie est une méthodologie intrinsèquement visuelle. Par conséquent, la technique peut être plus facile à comprendre en regardant en plus de la lecture.
Pour commencer, combinez la quantité appropriée de médias sériques réduits et de réaccélément de transfection dans un tube, et réduisez le média sérique et l’ADN dans un tube séparé. Incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, mélanger le contenu des deux tubes et incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
Utilisez un pipet multicanal et des auges en plastique de stérilisation pour laver les neurones corticals deux fois avec 100 microlitres de milieu basal neural par puits. Et stockez les médias conditionnés et les autres médias restants à 37 degrés Celsius. Remplacez le NBM par 100 microlitres de solution NBKY précédemment préparée par puits.
Après 20 minutes, pipet 50 microlitres du réagent de transfection et du mélange d’ADN tombent dans chaque puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Rincez les cellules deux fois avec la solution NBKY.
Ajoutez ensuite 100 microlitres de supports conditionnés et 100 microlitres de solution NBC aux puits. Pour commencer à imaginer les cellules, placez la plaque de puits 96 sur un microscope fluorescent. Utilisez une marque fiduciaire unique à chaque plaque comme référence pour l’alignement futur, et enregistrez une image pour référence future.
Ensuite, naviguez vers les zones d’intérêt et enregistrez leurs coordonnées x et y par rapport à la marque. Utilisez une marque fiduciaire unique à chaque plaque comme référence pour l’alignement futur, et enregistrez une image pour référence future. Enfin, concentrez-vous sur les cellules transfectées exprimant une étiquette fluorescente.
Prenez plusieurs images à intervalles réguliers espacés dans les canaux fluorescents appropriés. Pour commencer par le traitement d’image, cliquez deux fois sur l’icône Fidji. Ensuite, cliquez et faites glisser l’image souligner le traitement macro sur la barre Fidji pour ouvrir la macro au sein des Fidji.
Ajustez les lignes deux à sept de l’image soulignent le traitement macro selon le protocole de texte. Ensuite, cliquez sur la couture, puis la grille / couture de collecte. Ajustez les paramètres dans les menus d’abandon, tapez et commandez, jusqu’à ce qu’une image cousue avec précision soit produite.
Ajustez les variables de type grille et d’ordre de point dans les lignes huit et neuf selon ces sélections. Ensuite, ajustez la ligne 10 pour spécifier le nombre d’images par puits et réglez l’option de soustraction d’arrière-plan dans la ligne 14 pour vrai, si nécessaire. Ajustez la ligne 15 pour régler le rayon de roulement en fonction du protocole de texte et cliquez sur Exécuter.
Enfin, ouvrez les piles d’images de sortie et identifiez manuellement les neurones morts selon le protocole de texte. Enregistrez les données dans un fichier de feuille de calcul. Pour effectuer une analyse statistique, cliquez deux fois sur l’icône pour la survie.
Script R. Mettez en surbrillance la ligne deux et cliquez sur le bouton exécuter pour charger la bibliothèque de survie. Ensuite, modifiez le chemin dans la ligne cinq pour appeler la feuille de calcul d’entrée, et cliquez sur le bouton d’exécuter.
Mettez en évidence les lignes huit et neuf, et cliquez sur le bouton exécuter pour effectuer l’analyse des risques proportionnels Cox. Mettre en évidence les lignes 12 à 16 et 19 à 24. Cliquez sur le bouton exécuter pour tracer le risque cumulatif de décès et les données de survie comme une courbe Kaplan-Meier.
Dans cette étude, les neurones corticals de rat ont été transfectés à quatre jours après placage avec un plasmide codant la pomme fluorescente de protéine M. 24 heures après la transfection, les neurones ont été photographiés par microscopie de fluorescence toutes les 24 heures pendant 10 jours consécutifs. Après l’acquisition d’images, les images ont été traitées et examinées séquentiellement pour marquer la mort cellulaire.
L’heure du décès de chaque cellule a été déterminée par des changements dans la fluorescence, la morphologie et la fragmentation du corps cellulaire. L’analyse proportionnelle des dangers de Cox effectuée sur les données de survie des neurones mutants a donné lieu à un rapport de danger de 2,2. Ce résultat a indiqué un taux plus rapide de mortalité dans les neurones mutants par rapport à la population sauvage de type.
La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de pipet soigneusement. Il est essentiel de minimiser l’exposition à l’air et d’éviter les bulles pour réussir la transfection. Après la transfection, la microscopie longitudinale de fluorescence peut être employée pour suivre divers facteurs qui peuvent contribuer à la mort cellulaire, y compris la localisation de protéine, le chiffre d’affaires, et le niveau d’expression, en plus de la survie cellulaire.
Dans le domaine de la neurodégénérescence, la nature dynamique de la microscopie longitudinale a permis de déterminer si l’agrégation des protéines associées à la maladie représente un événement toxique ou protecteur. Aucun de ces reagents ou instruments n’est dangereux.
