פרוטוקול זה מאפשר לחוקרים לעקוב אחר הישרדות על בסיס תא יחיד ולזהות משתנים המנבאים באופן משמעותי מוות או הישרדות של תאים. בדיקות ציטוטוקסיות קונבנציונליות מעריכות אוכלוסיות של תאים וחסרות יכולת להפלות תאים בודדים. מיקרוסקופ אורך מאפשר את המשימה של זמן המוות עבור כל תא באוכלוסייה.
טכניקה זו מתאימה היטב להערכת טיפולים חדשים למחלות ניווניות ולתנאים אחרים. שיטה זו הוכיחה לא יסולא בפז לחקר מנגנוני המחלה בתנאים ניווניים, והוא יכול להיות מיושם ביעילות שווה כלפי הפרעות אחרות שבהן מוות תאי הוא עניין. חוקרים עשויים להיאבק בהשגת יעילות transfection נאותה ללא רעילות מופרזת.
תרגול עם צינור רב ערוצי והיכרות עם הפרוטוקול צריך להפחית קושי אלה לאורך זמן. מיקרוסקופיה היא מתודולוגיה חזותית מטבעה. לכן, הטכניקה עשויה להיות מובנת בקלות רבה יותר על ידי צפייה בנוסף לקריאה.
כדי להתחיל, לשלב את הכמות המתאימה של מדיה סרום מופחתת reagent transfection בצינור אחד, ו מדיה סרום מופחת DNA בצינור נפרד. דגירה אותם בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. לאחר מכן, לשלב את התוכן של שני צינורות דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
השתמש צינור רב ערוצי שוקת פלסטיק מעקר לשטוף את הנוירונים קליפת המוח פעמיים עם 100 microliters של מדיה בזלית עצבית לכל באר. ולאחסן את המדיה המותנה ומדיות אחרות שנותרו ב37 מעלות צלזיוס. החלף את ה- NBM ב- 100 מיקרוליטרים של פתרון NBKY שהוכן בעבר לבא.
לאחר 20 דקות, pipet 50 microliters של reagent transfection ותערובת DNA dropwise לתוך כל באר. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. יש לשטוף את התאים פעמיים באמצעות פתרון NBKY.
לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מדיה מותנה ו-100 מיקרוליטרים של פתרון NBC ל בארות. כדי להתחיל להדמיין את התאים, מניחים את צלחת 96 באר על מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד.
לאחר מכן, נווט לאזורי עניין והתאם את קואורדינטות ה- x וה- y שלהם ביחס לסימני הסימן. השתמש בסמל נאמנות ייחודי לכל לוח כהפניה ליישור עתידי, ושמור תמונה לעיון בעתיד. לבסוף, התמקדו בתאים המהונפים המבטאים תווית פלואורסצנטית.
לצלם תמונות מרובות במרווחים במרווחים קבועים בערוצים הפלואורסצנטיים המתאימים. כדי להתחיל בעיבוד תמונה, לחץ פעמיים על סמל פיג'י. לאחר מכן, לחץ וגרור את מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה אל סרגל פיג'י כדי לפתוח את המאקרו בתוך פיג'י.
התאם שורות 2 עד 7 של מאקרו עיבוד המקף התחתון של התמונה בהתאם לפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לחץ על תפירה ולאחר מכן רשת / אוסף תפירה. התאימו את הקצויים בתפריטים הנפתחים, הקלקו והסדר, עד להפקת תמונה תפורה במדויק.
התאם משתני סוג רשת וסדר תפר בשורות שמונה ותשע בהתאם לבחירה זו. לאחר מכן, התאימו את קו 10 כדי לציין את מספר התמונות ל באר והגדירו את אפשרות חיסור הרקע בשורה 14 כ- true, במידת הצורך. התאם את קו 15 כדי להגדיר את רדיוס הכדור המתגלגל בהתאם לפרוטוקול הטקסט ולחץ על הפעל.
לבסוף, פתח את ערימות תמונת הפלט וזהה באופן ידני את הנוירונים המתים בהתאם לפרוטוקול הטקסט. רשום את הנתונים בקובץ גיליון אלקטרוני. כדי לבצע ניתוח סטטיסטי, לחץ פעמיים על הסמל להישרדות.
R תסריט. סמן את קו 2 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לטעון את ספריית ההישרדות. לאחר מכן, שנה את הנתיב בשורה חמש כדי לקרוא לגיליון האלקטרוני של הקלט ולחץ על לחצן ההפעלה.
סמן את קווים 8 ו- 9 ולחץ על לחצן ההפעלה כדי לבצע את ניתוח הסיכונים היחסיים של Cox. סמן קווים 12 עד 16 ו- 19 עד 24. לחץ על לחצן הריצה כדי להתוות את הסיכון המצטבר למוות ואת נתוני ההישרדות כעיקול קפלן-מאייר.
במחקר זה, נוירונים קליפת המוח חולדה הונפו בארבעה ימים לאחר ציפוי עם פלסמיד קידוד חלבון פלואורסצנטי M תפוח. 24 שעות לאחר transfection, נוירונים דימוי על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי כל 24 שעות במשך 10 ימים רצופים. לאחר רכישת התמונה, תמונות עובדו ונבדקו ברצף כדי לסמן את מות התא.
זמן המוות של כל תא נקבע על ידי שינויים ב פלואורסצנטיות, מורפולוגיה ופיצול של גוף התא. ניתוח סכנות פרופורציונלי קוקס שבוצע על נתוני ההישרדות של נוירונים מוטנטים הביא יחס סיכון של 2.2. תוצאה זו הצביעה על קצב מוות מהיר יותר בנוירונים המוטנטים בהשוואה לאוכלוסיית סוגי הבר.
הדבר החשוב ביותר שיש לזכור בעת ניסיון הליך זה הוא צינור בזהירות. מזעור החשיפה לאוויר והימנעות מבועות הוא קריטי לתפנית מוצלחת. לאחר ההשתנות, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית אורך כדי לעקוב אחר גורמים שונים שעשויים לתרום למוות של תאים, כולל לוקליזציה של חלבונים, מחזור ורמת ביטוי, בנוסף להישרדות התאים.
בתחום ניוון עצבי, האופי הדינמי של מיקרוסקופיה אורך שפך אור על האם הצבירה של חלבונים הקשורים למחלות מייצג אירוע רעיל או מגן. אף אחד מהריגנסים או המכשירים האלה לא מסוכן.
