このプロトコルにより、研究者は単一細胞ベースで生存を監視し、細胞死または生存を有意に予測する変数を同定することができます。従来の細胞傷害性アッセイは、細胞の集団を評価し、個々の細胞を識別する能力を欠いている。縦方向顕微鏡検査では、集団の各細胞に対して死亡時間を割り当てることができる。
この技術は、神経変性疾患および他の条件に対する新しい治療法の評価に適しています。この方法は、神経変性疾患の疾患メカニズムを探求するのに非常に貴重であることが証明されており、細胞死が関心のある他の障害に対して同等の有効性を持って適用することができる。研究者は、過度の毒性なしに適切なトランスフェクション効率を達成することに苦労する可能性があります。
マルチチャンネルのパイプを使った練習とプロトコルの使い方は、時間の経過とともにこれらの難易度を減少させるはずです。顕微鏡は本質的に視覚的な方法論です。したがって、この技術は、読み取りに加えて見ることによってより容易に理解され得る。
まず、適切な量の減らされた血清培地とトランスフェクション試薬を1つのチューブに組み合わせ、別のチューブに減らされた血清培地とDNAを組み合わせます。室温で5分間インキュベートします。次いで、両チューブの内容物を組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。
マルチチャンネルピペットと滅菌プラスチックトラフを使用して、井戸あたり100マイクロリットルの神経基底メディアで皮質ニューロンを2回洗浄します。そして、条件付きのメディアや他の残りのメディアを摂氏37度で保管してください。NBMを、以前に調製したNBKY溶液を井戸ごとに100マイクロリットルに交換してください。
20分後、トランスフェクション試薬とDNA混合物の50マイクロリットルを各ウェルに滴下する。20分間摂氏37度で細胞をインキュベートします。NBKY溶液で細胞を2回リンスします。
その後、100マイクロリットルのコンディションされたメディアと100マイクロリットルのNBC溶液を井戸に加えます。細胞のイメージングを開始するには、96ウェルプレートを蛍光顕微鏡の上に置きます。将来の位置合わせの基準として、各プレートに固有の受託者マークを使用し、将来の参照のために画像を保存します。
次に、対象の領域に移動し、マークに対する相対位置の x 座標と y 座標を記録します。将来の位置合わせの基準として、各プレートに固有の受託者マークを使用し、将来の参照のために画像を保存します。最後に、蛍光標識を発現するトランスフェクト細胞に注目する。
適切な蛍光チャネルで、定期的に間隔を空けた間隔で複数の画像を撮影します。画像処理を開始するには、フィジーのアイコンをダブルクリックします。次に、画像アンダースコア処理マクロをフィジーバーにドラッグして、フィジー内でマクロを開きます。
テキストプロトコルに従って、画像アンダースコア処理マクロの2行から7行目を調整します。次に、ステッチをクリックし、グリッド/コレクションステッチをクリックします。正確にステッチされた画像が生成されるまで、ドロップダウンメニュー内の設定、タイプ、順序を調整します。
これらの選択に従って、8 行目と 9 行目のグリッドタイプとステッチ順序の変数を調整します。次に、10 行目を調整してウェルあたりの画像数を指定し、必要に応じて 14 行目の背景減算オプションを true に設定します。テキストプロトコルに従ってローリングボールの半径を設定するには、15行目を調整し、[実行]をクリックします。
最後に、出力イメージ スタックを開き、テキスト プロトコルに従って死んだニューロンを手動で識別します。スプレッドシート ファイルにデータを記録します。統計解析を実行するには、生存のアイコンをダブルクリックします。
R スクリプト。2 行目をハイライト表示し、実行ボタンをクリックしてサバイバルライブラリをロードします。次に、5 行目のパスを変更して入力スプレッドシートを呼び出し、[実行] ボタンをクリックします。
8 行目と 9 行目をハイライト表示し、実行ボタンをクリックして Cox 比例ハザード分析を実行します。12 から 16、19 から 24 をハイライトします。実行ボタンをクリックして、死亡の累積リスクと生存データをカプラン・マイヤー曲線としてプロットします。
本研究では、ラット皮質ニューロンを、蛍光タンパク質Mリンゴをコードするプラスミドをめっき後4日間でトランスフェクトした。トランスフェクション後24時間、ニューロンを10日間連続して24時間毎に蛍光顕微鏡で画像化した。画像取得後、画像を処理し、細胞死を示すために順次検査した。
各細胞の死亡時間は、蛍光、形態、および細胞体の断片化の変化によって決定された。突然変異ニューロンの生存データに対して行われたCox比例ハザード分析は、ハザード比2.2をもたらした。この結果は、野生型集団と比較して変異ニューロンにおける死亡率が速い。
この手順を試みる際に覚えておくべきことは、慎重にパイプ処理することです。空気暴露を最小限に抑え、気泡を避けることは、トランスフェクションを成功させるために重要です。トランスフェクション後、縦方向蛍光顕微鏡法を使用して、細胞の生存に加えて、タンパク質の局在化、ターンオーバー、発現量など、細胞死に寄与する可能性のあるさまざまな因子を追跡することができます。
神経変性の分野では、縦手方向顕微鏡の動的性質は、疾患関連タンパク質の凝集が有毒または保護事象を表すかどうかについて光を当てています。これらの試薬や器具はどれも危険ではありません。
