小规模提取 秀丽隐杆线虫 基因组DNA

我们开发了一种简单，快速且具有成本效益的方法来提取秀丽隐杆线虫基因组DNA，非常适合课堂和研究应用。这些实验方案可以可靠地用于从单个或一小部分C.elegance样品中快速生成DNA模板，用于基于PCR的应用。没有选择蠕虫或使用微管道的经验的用户可能会在需要这些技能的步骤中遇到困难。

观看熟练的从业者和练习可能会有所帮助。演示该程序的将是来自我实验室的高级研究生Farhan Lakdawala。为了从单个秀丽隐杆线虫中提取DNA，首先，设置裂解程序，包括一个循环在55摄氏度下10分钟，然后在95摄氏度下在热循环仪中三分钟。

为了制备裂解液，首先，从试剂盒中加入0.8微升的提取溶液到冰上0.2毫升PCR管的内壁。然后从试剂盒中加入0.2微升的组织制备溶液到提取溶液的液滴中，并通过peting混合。通过选择蠕虫进行DNA提取，首先，在解剖显微镜下鉴定L4或成年动物。

L4雌雄同体可以通过特征性外阴来识别，该外阴在动物中间可见为苍白的半圆。要识别成年雌雄同体，请选择平板上最大的动物之一，该动物的子宫中可能有可见的椭圆形胚胎。接下来，使用铂丝镐，将选定的动物转移到溶液中。

要收集管底部的内容物，请在室温下以2000×g离心管两到三秒钟。然后将试管放入热循环仪中，并运行先前设置的裂解程序。此裂解程序结束后，短暂离心管并将其放在冰上。

然后从试剂盒中加入0.8微升中和溶液，并通过移液混合。再次，在室温下以2000×g离心管两到三秒钟。如果不立即使用裂解液，请将管子储存在四摄氏度以备将来使用。

为了从单个蠕虫中提取DNA，首先，将一个周期的裂解程序设置为55摄氏度10分钟，然后在热循环仪中95摄氏度下进行三分钟。接下来制备裂解液，方法是首先将两微升的提取溶液从试剂盒中加入到冰上0.2毫升PCR管的内壁上，然后从试剂盒中加入0.5微升的组织制备溶液到提取液滴中，然后通过移液混合内容物。识别L4或成年动物后，使用铂丝镐将足够数量的动物转移到溶液中。

接下来，在室温下以2000×g离心管两到三秒钟，然后将管放入热循环器中并运行先前设置的裂解程序。程序完成后，短暂离心管并将其放在冰上。然后将两微升中和溶液从试剂盒中加入到管中并通过移液混合。

再次，在室温下以2000×g离心管两到三秒钟。如果不立即使用，请将裂解液储存在四摄氏度以备将来使用。通过方案提取的基因组DNA可以成功地用作PCR模板，商业试剂盒和传统的蛋白酶K方法都产生了与2100碱基对产品和500碱基对产物具有相似PCR扩增水平的DNA。

用于DNA裂解的试剂盒方法还提供了对多种DNA聚合酶有效的PCR模板。即使在不同的稀释度下，商业试剂盒从单个动物中提取的DNA也支持以同等效率扩增2100碱基对DNA片段的PCR扩增。然而，500个碱基对DNA片段的扩增随模板浓度而变化。

从单个动物或从多个动物中提取的DNA作为测定基因型的PCR模板的适用性通过基因及其突变变异的成功扩增进一步证明了。由于该方案涉及移液少量试剂，为确保一致性，请使用预混液进行多次反应，良好的管道技术和校准良好的移液器。此外，旋转管中的内容物可确保适当的裂解。

这种方法可以放大，适用于提取秀丽隐杆线虫基因组DNA用于其他下游应用，并可用于从其他线虫物种中提取DNA。鉴于该协议的简单性，速度，鲁棒性和低成本，它非常适合时间和资源有限的研究和课堂应用。