堆肥微观世界作为秀丽隐杆线虫微生物组研究的微生物多样化、类似自然的环境

该协议描述了如何饲养蠕虫和堆肥微观世界，从而能够在类似自然的环境中对宿主 - 微生物组相互作用进行实验室探索。这种方法提供了一种替代方法，可以将野生蠕虫与自然界隔离或使用有限微生物多样性的合成微生物群落。该协议很简单，可以在任何实验室中执行，甚至适合初学者。

首先，从任何方便的来源获取堆肥或花园土壤，并将其存放在实验室内的标准厨房塑料容器中，盖子上切孔以进行曝气。用棉絮堵住孔，以防止果蝇和其他无脊椎动物进入。用切碎的农产品或土壤中不同产品的混合物来丰富堆肥或土壤，以产生二比一的质量比例。

每天混合一次堆肥，并根据需要添加M9培养基，以保持水分而不会使其变得泥泞。对于每个微观世界，将 10 克浓缩堆肥添加到覆盖有锡纸的 30 毫升玻璃烧杯中。在每50毫升的管中加入30克浓缩的堆肥。

用M9填充管子并涡旋。在室温下以560G离心管5分钟。使用血清移液器，在不干扰沉淀的情况下去除上清液，并将它们合并到新的50毫升管中。

通过在室温下以最大速度离心管15分钟来浓缩细菌提取物。将颗粒重悬于足够的M9中，每个微观世界有200微升，板有200微升，板将作为微观世界的可见代表。将200微升浓缩的微生物提取物加入高压灭菌的堆肥烧杯和可见代理NGM板中。

向每个微观世界和代理板添加 500 至 1000 个 L1 幼虫。用薄纸在圆柱形 PVC 管上铺线。该圆柱体的底部应粘有一毫米的尼龙网。

将圆筒放入烧瓶中的贝尔曼漏斗中。在蠕虫微观世界中加入20毫升M9。搅拌混合物，然后将烧杯中的混合物倒入贝尔曼漏斗设置中的薄纸衬里圆筒中。

通过添加更多 M9 将堆肥完全浸入漏斗中。松开夹子，将含有收获蠕虫的滤液释放到50毫升的管中。然后通过在室温下以560G离心管两分钟来浓缩蠕虫。重复这些步骤，如果需要更多蠕虫，请从不同的轮次中拉出滤液。

用血清移液管除去上清液，同时在管中留下15毫升。将剩余的液体转移到15毫升管中，再次离心一分钟以进一步浓缩蠕虫。用血清移液管除去14毫升上清液。

同时，将一克剩余的微观土壤收集到1.5毫升的管中，同时处理手稿中所述含有环境细菌群落的土壤样品。使用玻璃移液管将一毫升浓缩收获的蠕虫转移到1.5毫升管中。孵育两分钟，让蠕虫沉淀在管底部。

除去上清液，同时将100微升沉淀不受干扰地留在管底部。用1.5毫升M9加Triton X清洗颗粒，让蠕虫每次都沉降在底部。使用玻璃移液管将100微升体积的洗涤蠕虫转移到新的1.5毫升管中。

为了使蠕虫麻痹，加入100微升25毫摩尔左旋咪唑盐酸盐，并在室温下孵育五分钟。加入 200 微升 4% 漂白剂溶液，孵育两分钟。取出上清液，让最底部的150微升不受干扰，并用M9加Triton X洗涤蠕虫颗粒三次.这些表面灭菌的蠕虫可以在零下20摄氏度下储存直到使用，以后可用于下游应用。

使用基于未加权或加权UniFrac距离的原理坐标分析比较蠕虫肠道微生物组和环境群落，显示蠕虫肠道微生物组与各自环境中的微生物组明显聚类。虽然基于未加权UniFrac距离的原理坐标分析没有区分土壤和蠕虫微生物组，但基于加权距离的聚类揭示了蠕虫肠道和堆肥微生物组的明显分离。在这项研究中，堆肥微观世界中产生的蠕虫用于16S测序，但也可用于测试不同环境微生物组对宿主对不利条件抵抗力的影响。

或者，可以从从堆肥微观世界中收获的蠕虫中分离出新的细菌分类群，以扩大蠕虫肠道共生体的已知分类和功能多样性。在其开发之后，microcosms管道有助于评估环境与宿主遗传因素在塑造肠道微生物组方面的贡献。