生成基于3-D胶原蛋白的水凝胶,分析神经系统发育过程中的Axonal生长和行为

该方法有助于分析某些分子在神经系统发育过程中在弓形指导和神经元迁移中的作用。该技术的主要优点是，结果分析是快速和简单的，不需要复杂的软件，这将意味着大量的培训研究人员。演示该程序将是米里安塞古拉-费利乌，一个技术人员从我们的实验室和我。

将20万个COS-1细胞开始放入35毫米培养皿中，并在细胞培养培养箱中用完整的培养，在一夜之间读取70至80%的汇合。第二天，用DNA对候选分子进行转染，使用基于脂体体的转染方法对候选分子进行编码。首先将250微升的血清自由介质和1至2微克DNA混合在1.5毫升离心管中，在室温下孵育5分钟。

要准备脂质体管，加入240微升的血清自由培养剂和10微升脂体转染试剂，并在室温下孵育5分钟。孵育后，将DNA管的含量加入唇管。在室温下轻轻混合和孵育15分钟。

用1.5毫升的血清自由培养剂取代培养细胞上的培养。慢慢加入DNA脂质体混合物，并明智地滴入细胞。在二氧化碳细胞培养孵化器中孵育三小时。

完成孵育后，用完整的培养培养本取代培养本，在孵化器中孵育。第二天，用0.1摩尔杜尔贝科的PBS冲洗细胞。每道菜加入800微升尝试素EDTA，在二氧化碳培养箱中孵育5至15分钟。

将两毫升完整培养培养的分离细胞收集到15毫升的离心管中，并加入10毫升的同一培养。在4摄氏度下将细胞在130倍g下离心5分钟。取出上一液，将含有COS-1细胞的颗粒保留在冰上。

制备胶原蛋白工作混合物后，将100至150微升的胶原蛋白混合物加入转染细胞的颗粒中，然后上下移液轻轻混合。将 45 至 50 微升胶原蛋白细胞颗粒混合物扩散到 35 毫米培养皿上，形成一个均匀的胶原蛋白细胞带，长约 1 至 1.5 厘米。将培养皿在37摄氏度和5%的二氧化碳下放在培养箱中，直到观察到凝胶。

在第二个培养盘中准备第二个包含控制细胞的条带，并放在培养箱中。凝胶完成后，将三到四毫升37摄氏度的加热COS-1完整的培养培养剂添加到每盘含有凝胶胶原蛋白细胞条的培养皿中，并将其放在培养箱中。使用细手术刀或组织斩波器切割胶原蛋白细胞条，生成长度为 400 到 500 微米的小块方形片段。

将所有部分从相同的转染条件转移到含有三到三点五毫升神经元培养素的培养皿。在解剖显微镜下检查碎片的质量，将盘子放在培养箱中。使用剪刀在胚胎第16.5天从牺牲怀孕的雌性大鼠的腹腔切割胚胎角，并把它们放入含有冷HSSG缓冲液的大培养皿中。

将盘子放在层流罩中，用直钳提取胚胎，并放入含有冷 HBBSg 的新盘中。用小钳子，去除皮肤，然后用弯曲和直钳，仔细解剖大脑，放入含有冷HPSSg的盘子。在解剖显微镜下，用手术刀或细剪刀将大脑沿着中线切成两半，以分离两个半球。

然后，取出死头和细钳，从脑片中去除脑和血管。使用 100% 乙醇清洁组织切碎器的所有部分，特别是 PTFE 切割板和剃须刀刀片，并在紫外线照射下将组织切碎器放在层流罩中 15 分钟。将每个组织片转移到组织切碎器的切割板。

组织被切碎后，从35毫米培养皿中转移，里面装满了三到四毫升完整的NCM。使用细钨针，完成组织解剖在完整的NCM。在解剖显微镜下检查获得的切片的质量，确保在暗场光学元件中可以清楚地识别这些层，并用钨针解剖感兴趣的区域。

将优质片件在二氧化碳培养箱中保持完整的 NCM 介质。视觉演示对于与共同文化准备相关的步骤至关重要，这些步骤有助于单词理解过程。将几个无菌的四孔培养板放在层流罩中，并像以前一样准备胶原蛋白工作混合物。

将15至20微升水凝胶混合物加入到每孔底部，形成圆形胶原蛋白基。将盘子放在培养箱中，直到观察到完全的凝胶。并检查凝胶胶原蛋白的质量。

使用移液器，将一小块 COS-1 细胞聚合转移到水凝胶基座上，然后使用移液器将组织块放在同一基座上，靠近一块细胞聚合体，距离一个外植大小。在冰上制备新的工作胶原蛋白混合物后，轻轻移液15至20微升这种新的混合物，以覆盖外植和细胞聚集体，使三明治像水凝胶培养。使用细钨针重新定向外植，使其面对500至600微米的细胞聚集。

将板返回培养箱，直到观察到凝胶，然后加入0.5毫升的完整NCM，辅以2%B27补充剂，并在培养箱中保持培养物36至48小时。当海马轴与Netrin-1对抗时，它们优先地向Netrin-1的来源发展，表明Netrin-1对于这些轴子起到化学吸引力的分子的作用。在控制条件或模拟转染中，所有轴子均径向增长，没有任何方向偏好。

当海马轴与Sema3E分泌细胞对峙时，它们中的大多数生长在细胞聚集物的对面，表明Sema3E充当这些轴子的化疗排斥分子。轴向和定量方法的原理图表示表明，在控制条件下，轴子在近位象限和近面象限中均等分布，以径向增长显示。这表示近近近近地或 PD 比率为 1。

当外植显示近位象限中轴子数量与近方位相比增加时，表示化疗具有吸引力，PD 比大于 1。当轴子的数量在近象限中高于近位象限时，表示化疗排斥，PD比率小于 1。按照这种方法，研究人员可以获取有关某些分子在神经元发育过程中作用的基本信息，从而使我们能够建立一个起点，进一步探索这些功能。

虽然这项技术在神经元发育中很有用，但它也可以作为策略应用于药理筛选、血管生成和组织工程。