Cette méthode est utile pour analyser le rôle de certaines molécules dans la guidage axonal et la migration neuronale pendant le développement du système neuro. Le principal avantage de cette technique est que l’analyse des résultats est rapide et simple et ne nécessite pas de logiciels complexes qui impliqueraient beaucoup de formation pour les chercheurs. Mirian Segura-Feliu, technicien de notre laboratoire et moi-même, démontrerons la procédure.
Pour commencer la plaque 200.000 cellules COS-1 dans des boîtes de Petri de 35 millimètres et incuber avec un milieu de culture complète dans un incubateur de culture cellulaire afin de lire 70 à 80% de confluence pendant la nuit. Le lendemain, pour transfecter les cellules COS-1 avec l’ADN codant la molécule candidate à l’aide de la méthode de transfection à base de liposome. Mélanger d’abord 250 microlitres de milieu sans sérum et un à 2 microgrammes d’ADN dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre et incuber à température ambiante pendant cinq minutes.
Pour préparer un tube liposomal, ajouter 240 microlitres du milieu sans sérum et 10 microlitres de réagent transfection liposomique, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Après l’incubation, ajouter le contenu du tube d’ADN au tube lipsomal. Mélanger délicatement et incuber à température ambiante pendant 15 minutes.
Remplacer le milieu sur les cellules de culture par 1,5 millilitres du milieu sans sérum. Ajouter le mélange de liposomes d’ADN lentement et laisser tomber sage aux cellules. Incuber dans l’incubateur de culture de cellules de dioxyde de carbone pendant trois heures.
Après l’incubation terminée, remplacer le milieu par le milieu de culture complet et incuber pendant la nuit dans l’incubateur. Le lendemain, rincer les cellules avec 0,1 molaire PBS Dulbecco. Ajouter 800 microlitres trypsine EDTA par plat et incuber pendant cinq à 15 minutes dans l’incubateur de dioxyde de carbone.
Recueillir les cellules détachées avec deux millilitres de milieu de culture complet dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et ajouter 10 millilitres du même milieu. Centrifuger les cellules à quatre degrés Celsius à 130 fois g pendant cinq minutes. Retirer le surnatant et conserver la pastille contenant des cellules COS-1 sur la glace.
Après avoir préparé le mélange de travail de collagène, ajouter 100 à 150 microlitres du mélange de collagène à la pastille des cellules transfected et mélanger doucement en pipetting de haut en bas. Étendre 45 à 50 microlitres de mélange de granulés de cellules de collagène sur une boîte de Pétri de 35 millimètres pour former une bande uniforme de cellules de collagène, d’environ un à 1,5 centimètre de long. Placez le plat dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que la gelation soit observée.
Préparer une deuxième bande contenant des cellules de contrôle dans un deuxième plat de culture et le placer dans l’incubateur. Lorsque la gelation est terminée, ajouter de trois à quatre millilitres de 37 degrés Celsius réchauffé COS-1 milieu de culture complète à chaque plat contenant les bandes de cellules de collagène gélisé et les placer dans l’incubateur. Utilisez un scalpel fin ou un hachoir de tissu pour couper les bandes de cellules de collagène pour générer de petits morceaux carrés, de 400 à 500 micromètres de longueur.
Transférez toutes les sections de la même condition de transfection à une boîte de Pétri contenant de trois à 3,5 millilitres de médias de culture neuronale. Vérifiez au microscope disséquant la qualité des pièces et placez la vaisselle dans l’incubateur. Utilisez des ciseaux pour couper les cornes embryonnaires le jour embryonnaire 16.5 de la cavité abdominale d’un rat femelle enceinte sacrifié et placez-les dans une grande boîte de Pétri contenant le tampon froid de HBSSg.
Placez le plat dans le capot d’écoulement laminaire et utilisez des forceps droits pour extraire les embryons et les placer dans un nouveau plat contenant du HBBSg froid. Avec de petits forceps, enlever la peau, puis avec des forceps incurvés et droits, disséquer soigneusement le cerveau et placer dans un plat contenant du HBSSg froid. Sous un microscope disséquant, à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux fins, couper le cerveau en deux le long de la ligne médiane pour séparer les deux hémisphères.
Ensuite, retirez le diencéphalon et avec des forceps fins, retirez les méninges et les vaisseaux sanguins des morceaux du cerveau. Utilisez 100% d’éthanol pour nettoyer toutes les parties de l’hélico tissulaire, en particulier la plaque de coupe PTFE et la lame de rasoir et garder l’hachoir de tissu dans le capot de flux laminaire sous l’éclairage UV pendant 15 minutes. Transférer chaque morceau de tissu dans la plaque de coupe de l’hélico tissulaire.
Après que le tissu a été haché, transférez les morceaux des plats petri de 35 millimètres remplis de trois à quatre millilitres de MR complet. À l’aide d’aiguilles de tungstène fines, terminer la dissection tissulaire dans le MR complet. Vérifiez la qualité des tranches obtenues au microscope à disséquer, en vous assurant que les couches sont clairement identifiables dans l’optique du champ sombre et disséquent la région d’intérêt avec des aiguilles de tungstène.
Gardez les pièces de bonne qualité dans le milieu NCM complet dans l’incubateur de dioxyde de carbone. La démonstration visuelle est essentielle dans les étapes liées à la préparation des co-cultures qui facilitent les mots pour comprendre le processus. Placez plusieurs plaques stériles de culture de quatre puits dans le capot d’écoulement laminaire et préparez un mélange de travail de collagène comme précédemment.
Ajouter 15 à 20 microlitres du mélange d’hydrogel dans le fond de chaque puits pour produire une base circulaire de collagène. Placer les plats dans l’incubateur jusqu’à ce qu’une gelation complète soit observée. Et vérifiez la qualité du collagène gélisé.
À l’intérieur d’une pipette, transférer un petit morceau d’agrégat de cellules COS-1 sur la base hydrogel, puis utiliser une pipette pour placer un morceau de tissu sur la même base, près du morceau de cellules agrégées à une distance d’une taille d’explant. Après avoir préparé un nouveau mélange de collagène de travail sur la glace, pipette doucement 15 à 20 microlitres de ce nouveau mélange pour couvrir l’explant et l’agrégat cellulaire, faisant un sandwich comme la culture hydrogel. Utilisez une fine aiguille de tungstène pour réorienter l’explantation afin qu’elle soit confrontée à l’agrégat cellulaire à 500 à 600 micromètres.
Retourner la plaque à l’incubateur jusqu’à ce que la gelation soit observée, puis ajouter 0,5 millilitres de MR complet complété par 2%B27 supplément et garder les cultures pendant 36 à 48 heures dans l’incubateur. Quand les axones hippocampal ont été confrontés à Netrin-1, ils se sont développés préférentiellement vers la source de Netrin-1, indiquant que Netrin-1 agit comme molécule attrayante de chimio pour ces axones. Dans l’état de contrôle, ou transfection simulée, tous les axones ont grandi radialement, sans aucune préférence directionnelle.
Quand les axones hippocampal ont été confrontés aux cellules sécrétantes de Sema3E, la plupart d’entre eux ont grandi en face de l’agrégat cellulaire, indiquant que Sema3E agit comme une molécule chimio répulsive pour ces axones. Cette représentation schématique de la réponse axonale et de la méthode de quantification montre que dans des conditions de contrôle, les axones ont été également distribués dans les quadrants proximaux et distal, montrés avec la croissance radiale. Ceci a indiqué un rapport proximal de distal ou de d’un.
Quand les explants ont montré le nombre accru d’axones dans le quadrant proximal par rapport au distal, indiquant l’attraction de chimio, le rapport de était plus grand qu’un. Lorsque le nombre d’axones était plus élevé dans le quadrant distal que dans le quadrant proximal, ce qui indique une répulsion chimio, le rapport était inférieur à un. Suivant cette méthode, les chercheurs peuvent obtenir des informations essentielles sur le rôle de certaines molécules lors du développement neuronal, ce qui nous permet d’établir un point de départ pour explorer davantage les fonctions.
Bien que cette technique soit utile dans le développement neuronal tel qu’il est, elle pourrait également être appliquée dans le criblage pharmacologique, l’angiogenèse, et l’ingénierie tissulaire comme stratégies.
