Este método é útil para analisar o papel de algumas moléculas na orientação axonal e migração neuronal durante o desenvolvimento do sistema neurológico. A principal vantagem dessa técnica é que a análise dos resultados é rápida e simples e não requer softwares complexos, o que implicaria muito treinamento para pesquisadores. Demonstrando o procedimento estará Mirian Segura-Feliu, técnica do nosso laboratório e eu.
Para iniciar a placa 200.000 células COS-1 em placas de Petri de 35 milímetros e incubar com meio de cultura completa em uma incubadora de cultura celular, a fim de ler 70 a 80% de confluência durante a noite. No dia seguinte, transfeccionar células COS-1 com o DNA codificando a molécula candidata usando o método de transfecção à base de lipososom. Misture primeiro 250 microliters de meio livre de soro e dna de um a 2 microgramas em um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos.
Para preparar um tubo lipossômico, adicione 240 microliters do meio sem soro e 10 microliters de reagente de transfecção liposômica, e incubar à temperatura ambiente por cinco minutos. Após a incubação, adicione o conteúdo do tubo de DNA ao tubo lipsômico. Misture delicadamente e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos.
Substitua o meio nas células cultivadas por 1,5 mililitros do meio livre de soro. Adicione a mistura de lipossomos de DNA lentamente e solte sábia às células. Incubar na incubadora de cultura celular de dióxido de carbono por três horas.
Após a incubação concluída, substitua o meio pelo meio de cultura completa e incubar durante a noite na incubadora. No dia seguinte, enxágue as células com PBS molar 0,1 molar Dulbecco. Adicione 800 microliters trypsin EDTA por cada prato e incubar por cinco a 15 minutos na incubadora de dióxido de carbono.
Colete células separadas com dois mililitros de cultura completa em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione 10 mililitros do mesmo meio. Centrifugar as células a 4 graus celsius a 130 vezes g durante cinco minutos. Remova o supernatante e preserve a pelota contendo células COS-1 no gelo.
Depois de preparar a mistura de trabalho de colágeno, adicione 100 a 150 microliters da mistura de colágeno à pelota das células transfeinadas e misture suavemente por pipetar para cima e para baixo. Espalhe de 45 a 50 microliters de mistura de pelotas de célula de colágeno em uma placa de Petri de 35 milímetros para formar uma banda uniforme de células de colágeno, aproximadamente de um a 1,5 centímetros de comprimento. Coloque o prato na incubadora a 37 graus celsius e 5% de dióxido de carbono até que a gelação seja observada.
Prepare uma segunda tira contendo células de controle em um segundo prato de cultura e coloque-a na incubadora. Quando a gelação estiver concluída, adicione três a quatro mililitros de 37 graus celsius aquecidos cos-1 meio de cultura completa para cada prato contendo as tiras de célula de colágeno gelada e colocá-los na incubadora. Use um bisturi fino ou um helicóptero de tecido para cortar as tiras das células de colágeno para gerar pequenos pedaços quadrados, de 400 a 500 micrômetros de comprimento.
Transfira todas as seções da mesma condição de transfecção para uma placa de Petri contendo de três a 3,5 mililitros de mídia de cultura neuronal. Verifique em um microscópio dissecando a qualidade das peças e coloque os pratos na incubadora. Use uma tesoura para cortar chifres de embrião no dia embrionário 16.5 da cavidade abdominal de um rato fêmea grávida sacrificado e colocá-los em uma grande placa de Petri contendo tampão HBSSg frio.
Coloque o prato na capa de fluxo laminar e use fórceps retos para extrair os embriões e colocá-los em um novo prato contendo HBBSg frio. Com pequenas fórceps, remova a pele e, em seguida, com fórceps curvados e retos, disseque cuidadosamente o cérebro e coloque em um prato contendo HBSSg frio. Sob um microscópio dissecando, usando um bisturi ou uma tesoura fina, corte o cérebro ao meio ao longo da linha média para separar ambos os hemisférios.
Em seguida, remova o diencephalon e com fórceps finos, remova meninges e vasos sanguíneos dos pedaços cerebrais. Use 100% de etanol para limpar todas as partes do helicóptero de tecido, especialmente a placa de corte PTFE e a lâmina de barbear e mantenha o helicóptero de tecido no capô do fluxo laminar sob iluminação UV por 15 minutos. Transfira cada peça de tecido para a placa de corte do helicóptero de tecido.
Depois que o tecido for cortado, transfira as peças das placas de Petri de 35 milímetros preenchidas com três a quatro mililitros de NCM completo. Usando agulhas de tungstênio finas, finalize a dissecção do tecido em NCM completo. Verifique a qualidade das fatias obtidas sob o microscópio dissecando, certificando-se de que as camadas são claramente identificáveis na óptica do campo escuro e disseque a região de interesse com agulhas de tungstênio.
Mantenha as peças de boa qualidade em meio NCM completo na incubadora de dióxido de carbono. A demonstração visual é fundamental nas etapas relacionadas à preparação das coculturas que facilitam a compreensão do processo. Coloque várias placas de cultura estéreis no capô de fluxo laminar e prepare uma mistura de trabalho de colágeno como anteriormente.
Adicione 15 a 20 microliters da mistura de hidrogel no fundo de cada poço para produzir uma base circular de colágeno. Coloque os pratos na incubadora até que a gelação completa seja observada. E verifique a qualidade do colágeno gelado.
Com uma pipeta, transfira um pequeno pedaço de célula COS-1 agregado para a base de hidrogel, em seguida, use uma pipeta para colocar uma peça de tecido na mesma base, perto do pedaço de células agregado a uma distância de um tamanho de explant. Depois de preparar uma nova mistura de colágeno de trabalho no gelo, gentilmente pipeta 15 a 20 microliters desta nova mistura para cobrir a explanta e o agregado celular, fazendo um sanduíche como a cultura hidrogel. Use uma agulha de tungstênio fina para reorientar a explanta para que ela fique de frente para o agregado celular de 500 a 600 micrômetros.
Devolva a placa à incubadora até que a gelação seja observada e adicione 0,5 mililitros de NCM completo suplementado com suplemento B27 de 2%e mantenha culturas por 36 a 48 horas na incubadora. Quando os axônios hipocampais foram confrontados com Netrin-1, eles cresceram preferencialmente para a fonte de Netrin-1, indicando que Netrin-1 age como uma molécula atraente para esses axônios. Na condição de controle, ou transfecção simulada, todos os axônios cresceram radialmente, sem qualquer preferência direcional.
Quando os axônios hipocampais foram confrontados com células secretas Sema3E, a maioria delas cresceu em frente ao agregado celular, indicando que o Sema3E age como uma molécula repulsiva de quimioterapia para esses axônios. Esta representação esquemática do método de resposta axonal e quantificação mostra que, em condições de controle, os axônios foram igualmente distribuídos em quadrantes proximais e distais, mostrados com crescimento radial. Isso indicou uma razão distal proximal ou DP de um.
Quando as explanações apresentaram aumento do número de axônios no quadrante proximal em comparação com o distal, indicando a atração da quimioterapia, a razão de DP foi maior que um. Quando o número de axônios foi maior no quadrante distal do que no proximal, indicando repulsão de quimioterapia, a razão de DP foi menor que um. Seguindo esse método, os pesquisadores podem obter informações essenciais sobre o papel de algumas moléculas durante o desenvolvimento neuronal, o que nos permite estabelecer um ponto de partida para explorar melhor as funções.
Embora essa técnica seja útil no desenvolvimento neuronal como esta é, ela também poderia ser aplicada na triagem farmacológica, angiogênese e engenharia de tecidos como estratégias.
