具有长距离纤维排列的微工程3D胶原蛋白水凝胶

这种方法使我们能够设计具有受控纤维排列水平的3D胶原蛋白水凝胶，以模拟体内健康和患病组织中发现的环境。该技术提供了一种简单的微流体方法来设计排列的胶原蛋白水凝胶，引入细胞并量化细胞在地形定义的3D环境中的行为。演示该程序的将是我的实验室的Neil Joshi，Mehran Mansouri，Ann Byerly和Justin Vidas。

首先，将 250 微米厚的 PDMS 片材安装在塑料载体上，并使用工艺切割机以 0.5 毫米的刀片深度、每秒 1 厘米的速度和高力切割微流体设计。使用超声波浴清洁微流体通道切口五分钟。用去离子水冲洗超声通道，并在100摄氏度的热板上干燥五分钟。

将通道存放在干净的、有盖的培养皿中直至使用。为了制造PDMS覆盖层并使表面功能化以供将来改性，通过在49毫升丙酮中加入1毫升氨丙基三乙氧基硅烷，在玻璃烧杯中制备2%氨丙基三乙氧基硅烷溶液。接下来，将25%戊二醛溶液稀释至5%去离子水中。

为每张 24 毫米 x 50 毫米的盖玻片制作两毫升溶液。使用 IPA 在浴超声仪中清洁盖玻片五分钟。使用去离子水从盖玻片上冲洗掉 IPA。

盖玻片上光滑的水膜表明 IPA 已彻底冲洗。将盖玻片在热板上在 100 摄氏度下干燥五分钟。将干燥的盖玻片放入干净的培养皿中，确保它们不会重叠。

使用电晕放电棒，将盖玻片暴露在电晕放电中，每个一分钟。在电晕暴露后五分钟内取出盖玻片，并将每个盖玻片浸入氨丙基三乙氧基硅烷溶液中 10 秒钟，确保盖玻片浸没然后，从氨丙基三乙氧基硅烷溶液中取出盖玻片，将它们浸入丙酮中 10 秒钟，然后用压缩空气干燥。将干燥的盖玻片放回培养皿中，处理过的一侧朝上。

将一毫升戊二醛溶液移液到每个盖玻片的表面上。尽可能多地覆盖表面，不要让溶液溢出盖玻片的边缘。让盖玻片与溶液接触30分钟，然后用去离子水冲洗20秒。

使用压缩空气干燥盖玻片，然后将它们放回培养皿中，等离子体处理的一面朝上 对于激光切割模块化磁性底座，请使用适当的激光设置（例如通过次数和功率）从 PMMA 层中切割出设计。应调整激光设置，以便磁体可以压在PMMA层中。用肥皂和水清洗激光切割零件，以去除激光切割过程中的碎屑。

不要使用溶剂，因为它们可能会在激光切割边缘传播微裂纹。要组装平台，请用手将磁铁推入激光切割底座。磁体的厚度必须小于PMMA基座的厚度，以确保磁体与基座表面齐平。

从压敏胶或 PSA 片上撕下背衬，然后将底座连接到经戊二醛处理的盖玻片上，功能化的一面朝上。轻轻地将 PDMS 通道切口放入框架定义的空腔中。用宽尖镊子向下按压以去除气泡并确保保形接触。

将牛血清白蛋白或经 BSA 处理的通道盖放在通道切口顶部，BSA 侧朝下。确保流体入口和出口与通道对齐。该设备已准备好注射胶原蛋白I。

将注射泵、冷冻无菌注射器、冷冻中和胶原蛋白 I 溶液和无菌 20 号90度角尖鲁尔锁针放入生物安全柜中。将胶原蛋白I溶液装入注射器中，避免气泡。将针尖连接到注射器上，将注射器装入注射泵，针头朝下，并用胶原蛋白I溶液灌注针头。

将注射泵设置为每分钟50至2， 000微升之间的所需流速。将准备好的PDMS通道放在实验室插孔上，并与针头水平。将针头插入 PDMS 通道的入口端口。

注射通道，直到 30 微升胶原蛋白滴在出口侧收集。放下实验室插孔，轻轻地将针头与新填充的通道分开。重复直到所有通道都充满胶原蛋白I溶液。

将填充的通道装入培养皿中，同时用干净的无绒湿巾浸有去离子水，以防止新形成的胶原蛋白I凝胶脱水。盖上培养皿，在剥离步骤之前将加载的通道放入培养箱中两个小时。对于剥离和培养基平衡，首先使用镊子取下PDMS盖，露出聚合的胶原蛋白I凝胶。

向孔中加入650微升内皮生长培养基。或者，连接另一个模块以引入额外的胶原层或提供培养基灌注功能。将设备在培养箱中放置至少四个小时以平衡凝胶和培养基。

在接种细胞之前更换培养基。将玻璃盖玻片功能化可实现通道提升，并将PDMS盖功能化为BSA防止胶原蛋白I附着。胶原I纤维排列在取下盖子后不受影响。

在基质的对齐片段上培养的HUVEC的图像显示，与具有随机纤维的片段上的HUVEC相比，肌动蛋白纤维排列增加。我们的方法使我们能够模拟肿瘤微环境并量化不同细胞类型的反应。我们还可以引入流道来支持长期实验。