Bu yöntem nöro sistem gelişimi sırasında aksonal rehberlik ve nöronal göç bazı moleküllerin rolünü analiz etmek için yararlıdır. Bu tekniğin en büyük avantajı, sonuçların analizinin hızlı ve basit olması ve araştırmacılar için çok fazla eğitim anlamına gelecek karmaşık yazılımlar gerektirmemesidir. Prosedürü gösteren mirian Segura-Feliu, bizim laboratuvar ve ben bir teknisyen olacaktır.
Plaka 200 başlamak için, 000 COS-1 hücreleri 35 milimetre Petri yemekleri içine ve bir hücre kültürü kuluçka tam kültür ortamı ile kuluçka amacıyla 70-80% birleştiği gece okumak için. Ertesi gün, lipozom bazlı transfeksiyon yöntemi ile aday molekülkodlama DNA ile transfect COS-1 hücreleri için. İlk karışımı 250 serum serbest orta ve 1-2 mikrogram DNA 1.5 mililitre centrifuge tüp ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Bir liposomal tüp hazırlamak için, serum serbest orta 240 mikrolitre ve lipozomal transfeksiyon reaktif 10 mikrolitre ekleyin ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Kuluçkadan sonra, DNA tüpünün içeriğini lipsomal tüpe ekleyin. Yavaşça karıştırın ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçka.
Kültürlü hücrelerdeki ortamı serumsuz ortam 1,5 mililitre ile değiştirin. YAVAŞ yavaş DNA lipozomkarışımı ekleyin ve hücrelere akıllıca bırakın. Karbondioksit hücre kültüründe üç saat kuluçka ya.
Kuluçka tamamlandıktan sonra, tam kültür ortamı ile orta değiştirin ve kuluçka gecede kuluçka. Ertesi gün, 0.1 molar Dulbecco's PBS ile hücreleri durular. Her çanak başına 800 mikrolitre tripsin EDTA ekleyin ve karbondioksit inkübatör beş ila 15 dakika kuluçka.
15 mililitrelik bir santrifüj tüpü içine tam kültür orta iki mililitre ile müstakil hücreleri toplamak ve aynı ortamda 10 mililitre ekleyin. Hücreleri dört derecede 130 kez g'de beş dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın ve buz üzerinde COS-1 hücreleri içeren pelet korumak.
Kollajen çalışma karışımı hazırladıktan sonra, transfected hücrelerin pelet kollajen karışımı 100 ila 150 mikrolitre ekleyin ve yukarı ve aşağı borulama yavaşça karıştırın. 35 milimetrelik Petri kabına 45 ila 50 mikrolitre kollajen hücreli pelet karışımı nı yayın ve yaklaşık 1 ila 1,5 santimetre uzunluğunda tek tip bir kollajen hücresi bandı oluşturun. Jelleşme gözlemlenene kadar 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit de kuvözde çanak yerleştirin.
İkinci bir kültür çanak kontrol hücreleri içeren ikinci bir şerit hazırlayın ve kuvöz yerleştirin. Jelasyon tamamlandığında, 37 santigrat derece üç ila dört mililitre ekleyin jelleştirilmiş kollajen hücre şeritleri içeren her çanak COS-1 komple kültür ortamı ısıtılır ve kuvöz yerleştirin. Küçük kare parçalar, uzunluğu 400 ila 500 mikrometre oluşturmak için kollajen hücre şeritleri kesmek için ince bir neşter veya doku helikopteri kullanın.
Aynı transfeksiyon durumundan tüm bölümleri üç ila 3,5 mililitre nöronal kültür ortamı içeren bir Petri kabına aktarın. Bir diseksiyon mikroskobu altında parçaların kalitesini kontrol edin ve kuvözde bulaşıkları yerleştirin. Embriyonik gün 16.5 bir kurban hamile kadın sıçan karın boşluğundan embriyo boynuzları kesmek için makas kullanın ve soğuk HBSSg tampon içeren büyük bir Petri kabına yerleştirin.
Lamina akış kaputuna çanak yerleştirin ve embriyoları ayıklamak ve soğuk HBBSg içeren yeni bir çanak içine yerleştirmek için düz forceps kullanın. Küçük forceps ile, deri kaldırmak ve sonra kavisli ve düz forceps ile, dikkatle beyin incelemek ve soğuk HBSSg içeren bir çanak içine yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskop altında, bir neşter veya ince makas kullanarak, her iki yarımküreyi ayırmak için orta hat boyunca beyin ikiye kesti.
Sonra, diensefalon kaldırmak ve ince forceps ile, beyin parçalarından menenjler ve kan damarları kaldırın. Doku helikopterinin tüm parçalarını, özellikle PTFE kesme plakasını ve jileti temizlemek için %100 etanol kullanın ve doku helikopterini UV aydınlatması altında laminar akı kaputunda 15 dakika tutun. Her doku parçasını doku helikopterinin kesme plakasına aktarın.
Doku doğrandıktan sonra, parçaları 35 milimetrelik Petri tabaklarından 3-4 mililitre tam NCM ile aktarın. Ince tungsten iğneler kullanarak, tam NCM doku diseksiyonu bitirmek. Diseksiyon mikroskobu altında elde edilen dilimlerin kalitesini kontrol edin, katmanların karanlık alan optiklerinde açıkça tanımlanabilir olduğundan emin olun ve tungsten iğneleri ile ilgi alanını inceleyin.
Karbondioksit inkübatör tam NCM ortamda kaliteli parçalar tutun. Görsel gösteri, sürecin anlaşılmasını kolaylaştıran ortak kültürlerin hazırlanmasıyla ilgili adımlarda önemlidir. Laminar akış kaputunda birkaç steril dört iyi kültür plakaları yerleştirin ve daha önce olduğu gibi bir kollajen çalışma karışımı hazırlamak.
Dairesel bir kollajen baz üretmek için her kuyunun altına hidrojel karışımı 15 ila 20 mikrolitre ekleyin. Tam jelleşme gözlenene kadar bulaşıkları kuvöze yerleştirin. Ve jellenmiş kollajen kalitesini kontrol edin.
Bir pipet le, küçük bir COS-1 hücre agregasını hidrojel tabanına aktarın, ardından aynı taban üzerine bir doku parçası yerleştirmek için bir pipet kullanın, bir ekstrüzyon büyüklüğünde bir uzaklıkta oluşan hücre parçasına yakın. Buz üzerinde yeni bir çalışma kollajen karışımı hazırladıktan sonra, hafifçe pipet 15-20 bu yeni karışımın mikrolitre ekstreğe ve hücre agrega kapsayacak şekilde, hidrojel kültürü gibi bir sandviç yapma. 500 ila 600 mikrometre hücre toplam yüzleri böylece explant reorientate için ince bir tungsten iğne kullanın.
Jelasyon gözlenene kadar kuvöz etabına plakayı geri döndürün ve sonra %2 B27 takviyesi ile tamamlanan 0,5 mililitre tam NCM ekleyin ve kültürleri kuvözde 36 ila 48 saat tutun. Hipokampal aksonlar Netrin-1 ile karşılaştıklarında tercihen Netrin-1'in kaynağına doğru büyüdüler ve Netrin-1'in bu aksonlar için kemo çekici bir molekül olarak hareket ettiğini belirttiler. Kontrol durumunda, ya da sahte transfeksiyon, tüm aksonlar radyal büyüdü, herhangi bir yön tercihi olmadan.
Hipokampal aksonlar Sema3E salgılayan hücrelerle karşılaştıklarında, çoğu hücre agregasının zıttı olarak büyüdü, bu da Sema3E'nin bu aksonlar için kemo itici bir molekül olarak hareket ettiğini gösteriyordu. Aksonal yanıt ve niceleme yönteminin bu şematik gösterimi, kontrol koşullarında aksonların radyal büyüme ile gösterilen proksimal ve distal kadranlarda eşit olarak dağıtıldığını göstermektedir. Bu bir proksimal distal veya PH oranı gösterdi.
Ekstremitelerde distal ile karşılaştırıldığında proksimal kadranda akson sayısı arttığında, kemo çekimi gösteren PD oranı birden fazlaydı. Distal kadranda akson sayısı proksimal olana göre daha yüksek olduğunda, kemo itme oranı birden daha azdı. Bu yöntemi takiben, araştırmacılar nöronal gelişim sırasında bazı moleküllerin rolü hakkında gerekli bilgileri elde edebilirsiniz, hangi bize daha fazla fonksiyonları keşfetmek için bir başlangıç noktası kurmak için izin verir.
Bu teknik nöronal gelişimde yararlı olmakla birlikte, farmakolojik tarama, anjiyogenez ve doku mühendisliğinde de strateji olarak uygulanabilir.
