Diese Methode ist nützlich, um die Rolle einiger Moleküle in der axonalen Führung und neuronalen Migration während der Entwicklung des Neurosystems zu analysieren. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass die Analyse der Ergebnisse schnell und einfach ist und keine komplexe Software erfordert, die viel Training für Forscher implizieren würde. Demonstrieren mirian Segura-Feliu, ein Techniker aus unserem Labor und ich.
Um 200, 000 COS-1-Zellen in 35 Millimeter Petrischalen zu starten und mit komplettem Kulturmedium in einem Zellkultur-Inkubator zu brüten, um 70 bis 80% Konfluenz über Nacht zu lesen. Am folgenden Tag, um COS-1-Zellen mit der DNA zu transfekieren, die das Kandidatenmolekül mit Liposomen-basierter Transfektionsmethode kodieren. Mischen Sie zunächst 250 Mikroliter Serumfreies Medium und ein bis 2 Mikrogramm DNA in einem 1,5 Milliliter Zentrifugenrohr und brüten bei Raumtemperatur fünf Minuten lang.
Um eine liposomale Röhre vorzubereiten, fügen Sie 240 Mikroliter des serumfreien Mediums und 10 Mikroliter liposomaler Transfektionsreagenz hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur fünf Minuten lang. Fügen Sie nach der Inkubation den Inhalt der DNA-Röhre in die lipsomale Röhre ein. Sanft mischen und bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubieren.
Ersetzen Sie das Medium auf den kultivierten Zellen durch 1,5 Milliliter des serumfreien Mediums. Fügen Sie die DNA-Liposomen-Mischung langsam hinzu und fallen Sie weise auf die Zellen. Inkubieren Sie im Kohlendioxid-Zellkultur-Inkubator für drei Stunden.
Nach der abgeschlossenen Inkubation das Medium durch das gesamte Kulturmedium ersetzen und über Nacht im Inkubator brüten. Am folgenden Tag spülen Sie die Zellen mit 0,1 molaren Dulbecco s PBS. Fügen Sie 800 Mikroliter Trypsin EDTA pro Gericht hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 15 Minuten im Kohlendioxid-Inkubator.
Sammeln Sie getrennte Zellen mit zwei Millilitern des gesamten Kulturmediums in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr und fügen Sie 10 Milliliter des gleichen Mediums hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei vier Grad Celsius bei 130 mal g für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und bewahren Sie das pellet enthaltende COS-1-Zellen auf Eis auf.
Nach der Herstellung der Kollagen-Arbeitsmischung 100 bis 150 Mikroliter der Kollagenmischung in das Pellet der transfizierten Zellen geben und sanft mischen, indem sie nach oben und unten pfeifen. 45 bis 50 Mikroliter Kollagenzellpelletmischung auf eine 35 Millimeter Petrischale verteilen, um ein gleichmäßiges Band von Kollagenzellen zu bilden, die etwa ein bis 1,5 Zentimeter lang sind. Legen Sie die Schale in den Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid, bis die Gelation beobachtet wird.
Bereiten Sie einen zweiten Streifen mit Kontrollzellen in einer zweiten Kulturschale vor und legen Sie ihn in den Inkubator. Wenn die Gelation abgeschlossen ist, fügen Sie drei bis vier Milliliter 37 Grad Celsius erwärmtes COS-1 komplettes Kulturmedium zu jedem Gericht hinzu, das die gegelten Kollagenzellstreifen enthält, und legen Sie sie in den Inkubator. Verwenden Sie ein feines Skalpell oder einen Gewebechopper, um die Kollagenzellstreifen zu schneiden, um kleine quadratische Stücke zu erzeugen, 400 bis 500 Mikrometer lang.
Übertragen Sie alle Abschnitte von der gleichen Transfektion summieren Sie auf eine Petrischale, die drei bis 3,5 Milliliter neuronaler Kulturmedien enthält. Überprüfen Sie unter einem Sezieren Mikroskop die Qualität der Stücke und legen Sie die Gerichte in den Inkubator. Verwenden Sie eine Schere, um Embryohörner am embryonalen Tag 16.5 aus der Bauchhöhle einer geopferten schwangeren weiblichen Ratte zu schneiden und legen Sie sie in eine große Petrischale mit kaltem HBSSg-Puffer.
Legen Sie die Schale in die laminare Fließhaube und verwenden Sie gerade Zangen, um die Embryonen zu extrahieren und legen Sie sie in eine neue Schale mit kaltem HBBSg. Mit kleinen Zangen, entfernen Sie die Haut, und dann mit gekrümmten und geraden Zangen, sorgfältig sezieren Sie das Gehirn und legen Sie in eine Schüssel mit kalten HBSSg. Unter einem Sezieren Mikroskop, mit einem Skalpell oder einer feinen Schere, schneiden Sie das Gehirn in der Mitte entlang der Mittellinie, um beide Hemisphären zu trennen.
Dann entfernen Sie diencephalon und mit feinen Zangen, entfernen Meninges und Blutgefäße aus den Hirnstücken. Verwenden Sie 100% Ethanol, um alle Teile des Gewebe-Choppers zu reinigen, insbesondere PTFE-Schneidplatte und die Rasierklinge und halten Sie den Gewebe-Chopper in der laminaren Flusshaube unter UV-Beleuchtung für 15 Minuten. Übertragen Sie jedes Gewebestück auf die Schneidplatte des Gewebehäckslers.
Nachdem das Gewebe gehackt wurde, übertragen Sie die Stücke aus den 35 Millimeter Petrischalen, gefüllt mit drei bis vier Millilitern kompletten NCM. Mit feinen Wolframnadeln, beenden Sie die Gewebesektion in vollständiger NCM. Überprüfen Sie die Qualität der erhaltenen Scheiben unter dem Sezieren Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Schichten in der Dunklen Feldoptik klar identifizierbar sind und sezieren Sie den Bereich von Interesse mit Wolframnadeln.
Bewahren Sie die hochwertigen Stücke in komplettem NCM-Medium im Kohlendioxid-Inkubator auf. Visuelle Demonstration ist entscheidend in den Schritten im Zusammenhang mit der Vorbereitung der Ko-Kulturen, die die Wörter erleichtert, um den Prozess zu verstehen. Legen Sie mehrere sterile vier Brunnenkulturplatten in die laminare Strömungshaube und bereiten Sie wie bisher eine Kollagen-Arbeitsmischung zu.
Fügen Sie 15 bis 20 Mikroliter der Hydrogelmischung in den Boden jedes Brunnens, um eine kreisförmige Kollagenbasis zu produzieren. Legen Sie die Gerichte in den Inkubator, bis eine vollständige Gelation beobachtet ist. Und überprüfen Sie die Qualität des gegelten Kollagens.
Mit einer Pipette ein kleines Stück COS-1-Zellaggregat auf die Hydrogelbasis übertragen und dann mit einer Pipette ein Gewebestück auf derselben Basis in der Nähe des Zellstücks in einem Abstand von einer Explantationsgröße platzieren. Nach der Vorbereitung einer neuen Arbeiten Kollagen-Mischung auf Eis, sanft Pipette 15 bis 20 Mikroliter dieser neuen Mischung, um das Explant und das Zellaggregat zu decken, so dass ein Sandwich wie Hydrogel-Kultur. Verwenden Sie eine feine Wolframnadel, um die Explantation neu zu orientieren, so dass sie dem Zellaggregat bei 500 bis 600 Mikrometern gegenübersteht.
Geben Sie die Platte an den Inkubator zurück, bis die Gelation beobachtet wird, und fügen Sie dann 0,5 Milliliter vollständiger NCM mit 2%B27 Ergänzung ergänzt und halten Kulturen für 36 bis 48 Stunden im Inkubator. Als Hippocampus-Axone mit Netrin-1 konfrontiert wurden, wuchsen sie bevorzugt in Richtung der Quelle von Netrin-1, was darauf hindeutet, dass Netrin-1 als Chemo-attraktives Molekül für diese Axone wirkt. In der Kontrollbedingung, oder Mock-Transfektion, wuchsen alle Axone radial, ohne jegliche Richtungspräferenz.
Als Hippocampus-Axone mit Sema3E-Sekretionszellen konfrontiert wurden, wuchsen die meisten von ihnen gegenüber dem Zellaggregat, was darauf hindeutet, dass Sema3E als chemoabstoßendes Molekül für diese Axone wirkt. Diese schematische Darstellung der axonalen Reaktions- und Quantifizierungsmethode zeigt, dass die Axone unter Kontrollbedingungen gleichmäßig in proximalen und distalen Quadranten verteilt waren, die mit radialem Auswuchs dargestellt wurden. Dies deutete auf ein proximales Distal- oder PD-Verhältnis von einem hin.
Wenn Explanten eine erhöhte Anzahl von Axonen im proximalen Quadranten im Vergleich zum distalen zeigten, was auf eine Chemoanziehung hindeutet, war das PD-Verhältnis größer als eins. Wenn die Anzahl der Axone im distalen Quadranten höher war als im proximalen, was auf Chemoabstoßung hindeutet, war das PD-Verhältnis geringer als eins. Nach dieser Methode können Forscher wichtige Informationen über die Rolle einiger Moleküle während der neuronalen Entwicklung erhalten, was es uns ermöglicht, einen Ausgangspunkt zu schaffen, um die Funktionen weiter zu erforschen.
Obwohl diese Technik in der neuronalen Entwicklung nützlich ist, wie dies ist, Könnte es auch in pharmakologischen Screening, Angiogenese, und Gewebe-Engineering als Strategien angewendet werden.
