使用微尺度热泳测量蛋白质-脂质相互作用

标记的微尺度热泳有效地获得各种生化相互作用的解离常数或KDs。该协议和随附的视频给出了Vam7（酵母中唯一可溶性SNARE蛋白）对磷脂酸的近似亲和力。这是Vam7在与其他蛋白质相互作用之前与两个膜结合的方式。

该方法以低成本，高再现性和最小的蛋白质成本快速获得KDs，用于各种生化相互作用。该技术适用于第一阶段药物开发，允许容易获得的KDs来确定潜在的先导化合物。在开始分析之前，请打开 MST 设备背面的电源开关，然后打开控制软件。

确认计算机已连接到设备并处于连接状态，并将“MST 之前”设置为 3 秒，将“MST”设置为 30 秒，将“荧光恢复”设置为 1 秒之后。对于每个毛细管，输入目标配体的名称、配体分析物的名称、目标的浓度以及使用自动填充滴定比的最高滴定浓度。选择一系列 MST 功率，并为每个功率输入值，以测试最稳健的结合拟合。

为了制备标记的MST样品，将Vam7-八硫噻嗪溶液稀释至200纳摩尔浓度，将NTA-Atto 647染料稀释至100纳摩尔浓度，均在PBS中。将Vam7-八噻嗪和NTA-Atto 647染料以1：1的体积比混合，让混合物在室温下避光30分钟。在孵育结束时，离心染料和蛋白质混合物，并在使用前将溶液在4摄氏度下储存长达几个小时。

然后，准备样品，取染色配体并暴露分析物。对于样品的微尺度热泳，打开设备并将毛细管架滑出。将样品毛细管装入位于第一位置浓度最高的样品架中，然后在控制软件中选择红色通道。

然后，将机架加载到仪器中。然后选择一个MST功率范围，开始电容扫描MST测量并评估偏移响应。这里显示了一项试验中的热泳痕量，该试验从500微摩尔开始对50纳米摩尔NTA-Atto 647标记的Vam7结构域进行1：1滴定DiC8 PA。

可以观察到初始荧光，时间跳跃和热泳，允许从这些测量的任意一个或组合中计算KD。可以从这些结果中绘制饱和曲线，例如，对于具有时间跳跃输出的热泳，如图所示。通常，MST结果使用对数尺度确定，同时考虑蛋白质浓度，通过选择KD模型并输入蛋白质浓度来确定结合亲和力。

执行此方案时，请确保溶液位于毛细管的中心，并且没有气泡，并且毛细管外部没有灰尘或溶液。等温滴定量热法或表面等离子体共振可用于验证所获得的实验KD。如果存在潜在的合作绑定，则在给定资源的情况下，ITC将是执行的下一个逻辑方法。

这项技术使传统的生物学研究人员能够将生物物理筛选技术纳入他们的研究中，以确定通路关系。这种技术的一个例子是细胞裂解酶，其靶蛋白内源性表达，其中GFP标签是执行传统下拉测定的新方法。